急性肺損傷大鼠各組織SP-A含量變化及相關性研究

李志軍鄭繼生李敏靜沈延飛蔡宛如

1浙江醫院呼吸科 杭州 310013 2浙江省立同德醫院呼吸內科3浙江中醫藥大學附屬第二醫院呼吸內科 4浙江省東陽市人民醫院重癥醫學科

急性肺損傷大鼠各組織SP-A含量變化及相關性研究

李志軍1鄭繼生2李敏靜3沈延飛4蔡宛如3

1浙江醫院呼吸科 杭州 310013 2浙江省立同德醫院呼吸內科3浙江中醫藥大學附屬第二醫院呼吸內科 4浙江省東陽市人民醫院重癥醫學科

目的 通過檢測急性肺損傷（ALI）模型大鼠肺、大腸等組織及肺泡灌洗液（BALF）、血清肺表面活化蛋白A（SP-A）含量變化并分析其相關性，為中醫“肺與大腸相表里”理論提供實驗依據。方法 采用脂多糖（LPS）氣道內滴入制備急性肺損傷（ALI）大鼠模型，應用ELISA方法分別檢測ALI及藥物干預后ALI大鼠肺、大腸等組織及肺泡灌洗液（BALF）、血清SP-A含量變化，并進行相關性分析。結果 隨著急性肺損傷加重，ALI模型大鼠肺、大腸、BALF及血清SP-A含量逐漸降低，藥物干預后能逆轉這種趨勢，呈一致性變化。且干預前后肺與大腸SP-A表達具有相關性（r= 0.521，r=0.615，P＜0.01）。結論 SP-A在肺和大腸組織的含量變化相關性最密切。

大鼠；急性肺損傷；肺表面活化蛋白A；肺與大腸相表里

肺表面活化蛋白A（surfactant protein A，SP-A）為肺表面活化蛋白中最早發現及含量最豐富者，是肺表面活性物質（pulmonary surfactant，PS）中最重要的蛋白成分，在維持PS結構和功能、降低肺表面張力、調節肺的免疫防御及炎癥反應等方面有重要作用。羅俊銘等[1]研究表明，SP-A相似分子在腸道上皮、腸道絨毛表面，連接組織血管和某些炎癥細胞中分布。Rubio等[2]也發現在大鼠腸道上皮細胞中能表達SP-A相似分子，并且其編碼序列與肺組織中的SP-A完全一致。結合“肺與大腸表里相合”的中醫理論，我們推測SP-A在肺與大腸組織中的表達可能存在著某種相關性，為此進行了相關研究，旨在為中醫“肺與大腸相表里”的理論提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 動 物 健康雄性SD大鼠120只，清潔級，體質量（200±20）g，由浙江中醫藥大學動物實驗中心提供（許可證號：SCXK（滬）2008-0016）。

1.2 試劑及材料 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（批號E.coli內毒素055：B5，美國Sigma公司）；SP-A ELISA試劑盒（美國RND公司進口分裝）；RIPA裂解緩沖液（普利萊基因技術有限公司）；蛋白酶抑制劑混合物（達文生物有限公司）。

1.3 藥 物 芪冬活血飲由黃芪、麥冬、虎杖、當歸按5：3：5：3比例組成，大黃湯由一味大黃組成。由浙江中醫藥大學制劑室制成，含生藥1g/mL，存放4℃冰箱保存。

2 實驗方法

2.1 急性肺損傷（acute lung injury，ALI）實驗 60只大鼠分為空白對照組、生理鹽水組、ALI 12h組、ALI 24h組、ALI 36h組和ALI 48h組，每組10只；ALI造模采用氣管內注入 LPS法制備 ALI大鼠模型（0.3mg/kg）[3]，生理鹽水（normal saline，NS）組及陰性對照組氣管內注入等量NS；空白對照組不作處理。

2.2 急性肺損傷藥物干預實驗 60只大鼠分為陰性對照組、模型組、芪冬活血飲組、芪冬大黃組、大黃組及地塞米松組，每組10只。ALI造模同上，藥物干預方法：①芪冬組在造模前24h、12h及造模后12h分別予芪冬活血飲8g/kg灌胃；②芪冬大黃組在造模前24h、12h及造模后12h分別予8g/kg芪冬活血飲和10g/kg大黃湯灌胃；③地塞米松組在造模前24h、12h及造模后12h分別予地塞米松5mg/kg灌胃；④大黃組在造模前24h、12h及造模后12h分別予大黃湯灌胃10g/kg；⑤陰性對照組及模型組在造模前24h、12h及造模后12h分別予等量生理鹽水灌胃。

2.3 標本采集及指標檢測 ALI 12h組、ALI 24h組、ALI 36h組、ALI 48h組分別于注入LPS后12、24、36、48h，NS組與空白對照組均于48h后；急性肺損傷干預后各組均在造模后24h，腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉大鼠，采集血清、肺泡灌洗液（BALF）及肺組織標本，組織勻漿獲取方法采取既往實驗所述[4]。采用ELISA檢測各組織SP-A含量。

2.4 統計學方法 應用SPSS17.0統計軟件進行數據分析，正態分布數據用One-way ANOVA檢驗，予以方差齊性檢驗，方差齊時組間比較用LSD法，方差不齊時組間比較用Tamhane's T2法。

3 實驗結果

3.1 各組大鼠組織SP-A含量比較 隨著LPS作用時間延長，肺、大腸組織、BALF及血清SP-A含量呈逐步下降趨勢，ALI 12h組、ALI 24h組、ALI 36h組及ALI 48h組均明顯低于NS組和空白對照組（P＜0.05或P＜0.01）。ALI 24h組、ALI 36h組及ALI 48h組肺、血清SP-A含量顯著低于ALI 12h組（P＜0.05或P＜0.01）；ALI 48h組大腸、BALF的SP-A含量顯著低于ALI 24h組（P＜0.01）；皮膚組織SP-A含量隨著LPS作用時間的延長變化不明顯（P＞0.05）；空白對照組肝組織SP-A含量顯著高于其它各組（P＜0.05）；ALI 48h組皮膚組織中SP-A含量最低，與空白對照組、NS組、ALI 12h組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠肺、大腸、BALF、血清、皮膚及肝組織SP-A含量比較（±s） ng/L

表1 各組大鼠肺、大腸、BALF、血清、皮膚及肝組織SP-A含量比較（±s） ng/L

注：與NS組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與ALI 12h組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與ALI 24h組比較，◇P＜0.05，◇◇P＜0.01

組別空白對照組NS組ALI12h組ALI24h組ALI36h組ALI48h組n/只10 10 10 10 10 10肺肝176.36±27.81* 236.72±44.86 151.87±24.90* 119.63±11.93*△△▲110.00±12.88*△△▲112.51±10.88**△△▲大腸85.20±8.11 89.03±10.21 74.52±11.01* 72.54±18.48*△△59.76±14.15*△△◇53.29±12.76**△△◇◇BALF 439.17±26.09** 528.04±34.81 456.84±65.78** 404.49±30.48**▲372.79±37.31**△△▲▲348.12±59.44**△△◇◇血清439.00±12.98 473.68±35.21△▲430.67±30.28 394.68±53.36**△△▲389.65±45.53**△△▲388.27±42.21**△△▲皮膚80.41±16.45 88.47±8.31 87.16±9.26 68.93±22.11 74.74±15.28 4.91±14.55*△▲126.77±30.10 82.33±11.53△86.68±8.66△87.58±13.76△80.24±4.97△86.22±6.87△

表2 干預后各組大鼠肺、大腸、血清及BALF SP-A含量比較（±s） ng/L

表2 干預后各組大鼠肺、大腸、血清及BALF SP-A含量比較（±s） ng/L

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與地塞米松組比較，▲P＜0.05；與芪冬大黃組比較，◇P＜0.05

組別陰性對照組模型組DXM組芪冬大黃組芪冬組大黃組n/只10 10 10 10 10 10血清431.09±27.82 332.28±11.18** 400.55±44.73△△380.56±43.78**△△379.87±17.68**△△371.16±45.91**△△BALF 485.29±19.65 375.68±20.41* 433.23±34.50*△443.75±65.42*△411.64±61.00* 404.36±37.11*肺190.75±15.17 120.85±9.33** 179.43±24.02△△178.40±19.39△△158.39±18.96**△△▲◇160.89±8.46**△△▲◇大腸82.36±6.18 64.47±5.67** 78.04±5.39△△75.88±4.68△△71.13±4.57** 69.20±6.58**

3.2 干預后大鼠各組織SP-A含量比較 模型組肺、大腸、BALF及血清SP-A含量較對照組均有不同程度降低（P＜0.05或P＜0.01），經地塞米松、芪冬活血飲、大黃和芪冬活血飲聯合大黃藥物干預后均有恢復，干預后肺、大腸、BALF及血清中SP-A變化規律具有一致性。見表2。

3.3 ALI大鼠肺組織與其它組織SP-A含量相關性分析 對ALI大鼠肺組織SP-A與BALF、大腸、皮膚、肝組織及血清SP-A表達進行相關性分析，相關系數 r分別為 0.658、0.521、0.445、0.106、0.626，ALI大鼠肺組織SP-A表達與BALF、大腸、皮膚、血清SP-A表達具有相關性（P＜0.01）。ALI大鼠干預后肺組織SP-A與BALF、大腸及血清SP-A含量進行相關性分析，相關系數r分別為0.418、0.615、0.558，均具有相關性（P＜0.01）。

4 討論

“肺與大腸相表里”理論源于《黃帝內經》，它是中醫學論述臟腑表里關系的重要內容之一，《靈樞·本輸》篇稱這種關系為“肺合大腸，大腸者，傳導之府也”，《素問·血氣形志》篇稱之為“陽明與太陰為表里”。在生理上體現了肺主氣和大腸主傳導之間的相互作用；病理上體現肺和大腸在病變時相互影響；治療上體現臟病腑治、腑病臟治、臟腑同治提高臨床療效。盡管該理論在長期的臨床實踐中行之有效，但仍有必要借助分子生物學手段來深入闡釋其內在的本質聯系。

本實驗結果顯示，隨著LPS作用時間的延長，ALI大鼠肺及大腸組織、BALF及血清SP-A含量呈逐步下降趨勢（P＜0.05或P＜0.01），而皮膚及肝組織不存在上述變化，表明SP-A含量在肺與大腸、血清和BALF中具有一致性變化。進一步對肺組織與BALF、大腸、皮膚、肝組織及血清SP-A含量變化進行相關性分析，提示肺組織SP-A表達與BALF、大腸、皮膚及血清SP-A表達均呈正相關，同肝組織無明顯相關（r=0.106，P＞0.05），但在肺外臟器中，同大腸的相關性最密切（r=0.521，P＜0.01）。

筆者發現，LPS氣管內局部滴注誘導ALI后24h，肺組織和大腸組織SP-A含量均呈現下降，而這種下降經藥物干預后均有不同程度的恢復，提示SP-A在肺組織和大腸組織的表達呈一致性。進一步通過對肺與大腸、血清及BALF SP-A的含量進行相關性分析，結果發現干預后肺組織SP-A濃度同BALF、大腸及血清的SP-A濃度均呈正相關，但與大腸相關最密切。

總之，本實驗發現SP-A在肺與大腸含量變化的相關性最密切，提示SP-A可能是中醫“肺與大腸相表里”的物質基礎之一。

［1］羅俊銘，劉昭前，Chin Y.Eugene.肺表面活化蛋白A相似分子在炎癥腸道疾病組織中的過量表達［J］.中南大學學報（醫學版），2008，33（11）：979-986.

［2］Rubio S，Lacaze-Masmonteil T，Chailley-Heu B，et al.Pulmonary surfactant protein A（SP-A）is expressed by epithelial cells of small and large intestine［J］.Biol Chem，1995，270：12062-12063

［3］朱耀斌，李曉鋒，張燕博，等.急性肺損傷動物模型［J］.中華實用診斷與治療雜志，2011，25（7）：625-628.

［4］李志軍，丁志山，董雷，等.芪冬活血飲對急性肺損傷大鼠肺表面活性蛋白A在肺與大腸表達的影響及相關性研究［J］.中華中醫藥雜志，2013，28（3）：698-702.

［5］ Liu J，Hu F，Wang G，et al.Lipopolysaccharide-induced expression of surfactant proteins A1 and A2 in human renal tubular epithelial cells［J］.J Inflamm（Lond），2013，10（1）：2.

Change of SP-A in Several Tissues of Acute Pulmonary Injury Rats

LI Zhijun1，ZHENG Jisheng2，LI Min-jing3，SHEN Yanfei4，CAI Wanru3. 1.Department of Respiratory Diseases，Zhejiang Hospital，Hangzhou（310013），China;2.Department of Respiratory Diseases，Zhejiang Provincial Tongde Hospital;3.Department of Respiratory Diseases，the Second Hospital affiliated to Zhejiang Chinese Medical University;4.Department of Severe Diseases，Dongyang People's Hospital.

Objective To detect the change of SP-A in several tissues of rats with acute lung injury（ALI）and further discuss the SP-A correlation in different tissues,so as to provide experimental basis for the Traditional Chinese Medical theory"The lung and large intestine have an exterior-interior relationship". Methods ALI model was made by instilling lipopolysaccharide into in trachea of rats.The level of SP-A was detected by ELISA in lung and large intestine tissues and serum samples and BALF of ALI rats before and after interfering.A correlation analysis was carried out.Results With the aggravation of ALI,the level of SP-A in lung and large intestine tissue,BALF and serum samples were gradually declining,but the deceased was reversed by drug treatment,showing a consistency change.The level of SP-A in lung tissue was correlated with that in large intestine tissue（r=0.521 in ALI and r=0.615 after intervening,P＜0.01）.Conclusion The SP-A in lung tissue is closely related with that in large intestine.

rats；acute lung injury；SP-A；Lung and large intestine have exterior-interior relationship

2014-04-24

修改日期：2014-06-25

浙江省自然科學基金（No.Y2091208）

蔡宛如，Tel：0571-85267000；E-mail：caiwanru@yahoo.com.cn