炙馬錢子對自身免疫性重癥肌無力模型大鼠免疫調(diào)節(jié)機制研究

鄒 瑩裘 濤楊 峰

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院臨床心理科 杭州 310005 2浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 3浙江中醫(yī)藥大學(xué)

炙馬錢子對自身免疫性重癥肌無力模型大鼠免疫調(diào)節(jié)機制研究

鄒 瑩1裘 濤2楊 峰3

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院臨床心理科 杭州 310005 2浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 3浙江中醫(yī)藥大學(xué)

目的 探討炙馬錢子對實驗性自身免疫性重癥肌無力（EAMG）模型大鼠的免疫調(diào)節(jié)機制。方法 采用鼠源乙酰膽堿受體α亞基97-116肽段方法免疫Lewis大鼠建立EAMG模型，觀察實驗大鼠的臨床表現(xiàn)，并將建模成功的EAMG大鼠隨機分為模型組、強的松組及炙馬錢子低、中、高劑量組，每組8只。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法檢測各組大鼠血清乙酰膽堿受體抗體（AChRab）和白介素6（IL-6）含量比較各組之間差異。結(jié)果 模型組大鼠血清AChRab和IL-6含量較正常組顯著升高（P均＜0.01）。炙馬錢子高劑量組AChRab含量較中、低劑量組下降更顯著（P均＜0.01），與強的松組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；炙馬錢子中、高劑量組IL-6含量均低于強的松組（P均＜0.01）；炙馬錢子中、高劑量組間IL-6含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 炙馬錢子能降低EAMG模型大鼠血清AChRab和IL-6含量，抑制T、B細胞活化，減輕對突觸后膜AchR的損害，緩解EAMG病情，一定劑量范圍內(nèi)的炙馬錢子在免疫調(diào)節(jié)方面表現(xiàn)優(yōu)于強的松。

大鼠；自身免疫性重癥肌無力；乙酰膽堿受體抗體；白細胞介素6；炙馬錢子；強的松

重癥肌無力（myasthenia gravis，MG）是一種神經(jīng)-肌肉接頭傳遞障礙的獲得性自身免疫性疾病，主要是由血清中乙酰膽堿受體抗體（AChRab）增高和在突觸后膜上的沉積導(dǎo)致有效AChR數(shù)目減少而引起的受累肌群無力的癥狀。目前西醫(yī)主要有長期的膽堿酯酶抑制劑、激素及免疫抑制劑治療，靜脈注射丙種球蛋白、血漿置換、胸腺切除等療法。中醫(yī)則主要以“精不足，則補之以味，而形不足，則溫之以氣”為治法進行藥物配伍。浙江省中醫(yī)院將炙馬錢子作為院內(nèi)制劑用于治療重癥肌無力已有三十余年，取得較好的臨床療效，未見明顯不良反應(yīng)。從國內(nèi)已有的少數(shù)報道來看，馬錢子治療MG有初步療效。本實驗通過對炙馬錢子治療實驗性自身免疫性重癥肌無力（EAMG）大鼠的觀察，初步揭示其治療MG的免疫調(diào)節(jié)機制，報道如下。

1 實驗材料

1.1 動 物 雌性8周齡的Lewis大鼠50只，浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物合格證號：SCXK（滬）2012-0002，體質(zhì)量208～256g。SPF級條件下飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，滅菌水及飼料供動物自由攝入。

1.2 主要藥物 炙馬錢子膠囊（生產(chǎn)批號130320，浙江省中醫(yī)院，批準文號：浙藥制字Z20100263），200mg/粒；新斯的明注射液（生產(chǎn)批號11071，上海信誼金朱有限公司，批準文號：H31022770），1mg/支；阿托品注射液（生產(chǎn)批號20120622，浙江瑞新藥業(yè)股份有限公司，批準文號：H33020456），0.5mg/支；強的松片（生產(chǎn)批號120807，浙江仙琚制藥股份有限公司，批準文號：H33021207），5mg/片，實驗時用0.2%的梭甲基纖維素鈉將其配制成所需濃度的混懸液。

1.3 主要試劑 鼠源性乙酰膽堿受體-a亞基97-116肽段序列（the rat sequence 97-116 of the AChR a subunit，R97-116）、完全福氏佐劑（CFA）、磷酸緩沖液（PBS），大鼠IL-6（貨號CK-E30646R）、AChRab（貨號CK-E30324R）ELISA檢測試劑盒。

2 實驗方法

2.1 EAMG動物模型建立 參考許文華等[1]的R97-116復(fù)制EAMG實驗動物模型。將R97-116、CFA、PBS三者按1:1.5:1.5的比例充分混勻制成免疫乳劑；首次免疫：取乳劑200μL（含R97-116:100μg）于造模鼠足墊、腹部、背部多點皮下注射，正常對照組皮下注射等量PBS；首次免疫后第30天及第45天，取乳劑200μL（含R97-116:50μg）強化接種，A組注射等量PBS。

2.2 EAMG動物模型評估

2.2.1 臨床評估 通過測量體質(zhì)量和肌力來評價疾病嚴重性。①實驗前及接種后每周2次稱重，末次免疫2周后觀察其攝食、姿勢及活動情況；②測量肌力（即讓鼠重復(fù)抓握籠頂30s再測量）采用Lennon等[2]的分級法予以臨床評分，肌力具體分級為：0級，無肯定的肌無力表現(xiàn)；1級，撕咬無力，四肢力量差，在光滑地面上前肢打滑，活動減少且容易疲勞；2級，明顯無力，在抓握前就出現(xiàn)震顫、低頭、隆背，抓握力弱；3級，在抓握前即有嚴重的肌無力表現(xiàn)，無力抓握，頻死狀態(tài)；4級，死亡。癥狀居中間者分別評分為0.5、1.5、2.5和3.5級。

2.2.2 新斯的明試驗 用腹腔注射法給予新斯的明（37.5μg/kg）和硫酸阿托品（15μg/kg），12min后大鼠肌無力癥狀可緩解，持續(xù)2～12h。

2.3 實驗動物分組及處理 從50只大鼠中隨機取8只作為正常組，其余42只進行EAMG造模。在R97-116免疫大鼠的第2周末，對實驗大鼠進行模型評估，確定建模成功40只。然后，將這40只EAMG成模大鼠隨機分為模型組、陽性藥物組（強的松組）、炙馬錢子低、中、高劑量組，每組8只。炙馬錢子低、中、高劑量組分別以75、150、225mg/（kg·d）的劑量（分別按照50kg成人每日用藥為0.6g、1.2g和1.8g劑量換算）灌胃治療，每天1次；陽性藥物對照組以強的松4mg/（kg·d）的劑量（按照50kg成人每日用藥30mg劑量換算）灌胃治療，每天1次；正常組、模型組稱重后給予藥液等量的蒸餾水灌胃，共治療28天。實驗過程中炙馬錢子高劑量組于灌胃后次日死亡2只大鼠，故最后確定送檢標本為5只，其余各組均6只。

2.4 檢測指標及方法 各組治療28天后，禁食12h；采用眼球取血法取靜脈血1.5mL，靜置30min后，經(jīng)3000rpm，離心10min，取上層血清，放置-20℃冷凍保存待測。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法分別檢測體液免疫指標乙酰膽堿受體抗體（AChRab）及細胞免疫指標白細胞介素6（IL-6）。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s） 表示；對于總體分布不明的小樣本資料，各組間結(jié)果的比較采用非參數(shù)檢驗，若符合正態(tài)分布且方差齊性的則采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 一般狀況觀察 正常對照組8只大鼠均未出現(xiàn)肌無力癥狀；其余大鼠在接受R97-116免疫后的第1周均出現(xiàn)了短暫性的肌無力癥狀，且未經(jīng)治療可自行緩解；第二次免疫后，部分大鼠出現(xiàn)進食減少，精神萎靡，活動減少等表現(xiàn)，但是肌無力表現(xiàn)不典型；追加免疫后，多數(shù)實驗大鼠表現(xiàn)叫聲低弱，對環(huán)境刺激反應(yīng)遲鈍，少動，毛發(fā)干枯，嘶咬無力且易疲勞，蜷縮拱背，四肢的肌無力癥狀比較典型，但無呼吸困難，脫水等危重表現(xiàn)。采用新斯的明試驗及Lennon評分法對末次免疫2周后的大鼠進行評估，新斯的明試驗陽性率95.24%（42只大鼠中有40只試驗陽性），Lennon臨床評分0.5～2級，以評分1級及以上為肌無力陽性，陽性率83.33%（其中1級大鼠26只，2級大鼠9只）。因此，最后確定EAMG建模成功的大鼠共40只。

3.2 各組大鼠血清AChRab含量比較 模型組大鼠血清AChRab含量明顯升高，與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；藥物干預(yù)后，各組AChRab含量均有下降，其中強的松組和炙馬錢子高劑量組比模型組顯著降低（P＜0.01），炙馬錢子低劑量組AChRab含量顯著高于強的松組（P＜0.05），炙馬錢子高劑量組AChRab含量明顯低于中、低劑量組（P均＜0.01），雖略低于強的松組，但組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清AChRab含量比較（±s）

表1 各組大鼠血清AChRab含量比較（±s）

注：與模型組比較，△P＜0.01；與強的松組比較，*P＜0.05；與高劑量組比較，▲P＜0.01

n/只組別正常組模型組強的松組炙馬錢子低劑量組炙馬錢子中劑量組炙馬錢子高劑量組666665 AChRab/（pmol/mL）106.757±11.874△212.082±22.987 126.860±7.040△184.903±16.384*▲148.378±9.689▲124.566±9.138△

3.3 各組大鼠血清IL-6含量比較 模型組大鼠血清IL-6含量顯著升高，與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；藥物干預(yù)后，各組IL-6含量均較模型組顯著降低（P＜0.01）；炙馬錢子中、高劑量組IL-6含量均低于強的松組（P均＜0.01）；炙馬錢子中、高劑量組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清IL-6含量比較（±s）

表2 各組大鼠血清IL-6含量比較（±s）

注：與模型組比較，△P＜0.01；與強的松組比較，*P＜0.01

組別正常組模型組強的松組炙馬錢子低劑量組炙馬錢子中劑量組炙馬錢子高劑量組n/只666665 IL-6/（pg/mL）47.645±10.215△111.815±7.149 99.268±5.956△94.992±6.029△82.548±4.888△* 75.976±6.016△*

4 討論

MG確切的發(fā)病機制至今仍不完全明確。研究表明，它可能是一種由多基因調(diào)控、多種機制參與的復(fù)雜性疾病[3]。

藥理研究證實，馬錢子的主要成分士的寧能選擇性地提高脊髓興奮功能，治療劑量能使脊髓反射的應(yīng)激性提高，反射時間縮短。神經(jīng)沖動容易傳導(dǎo)，骨骼肌的緊張度增加，從而使肌無力狀態(tài)得到改善[4]。

MG發(fā)生的關(guān)鍵在于機體針對AChR發(fā)生的免疫應(yīng)答異常。因此，AChRab是引起MG的重要因素之一，也是本實驗造模的主要理論依據(jù)。AChR多存在于神經(jīng)肌肉接頭的突觸后膜、部分前膜、神經(jīng)節(jié)細胞突觸表面等處，AChRab與AChR結(jié)合后使得AChR降解加快，導(dǎo)致突觸后膜AChR數(shù)量減少，影響神經(jīng)肌肉接頭功能。研究[5-6]發(fā)現(xiàn)，AChRab可能通過三種機制影響神經(jīng)肌肉的連接功能：①與AChR結(jié)合觸發(fā)補體瀑布鏈，進而形成膜攻擊復(fù)合體（MAC），引起神經(jīng)肌肉接頭（NMJ）處突觸后膜的局部破壞；②在NMJ突觸后膜與AChR分子產(chǎn)生交叉聯(lián)合導(dǎo)致AChR分子的細胞內(nèi)吞和降解作用；③與AChR上的ACh位點結(jié)合，阻斷NMJ突觸后膜AChR與ACh的正常聯(lián)合。本實驗中模型組大鼠血清AChRab含量明顯高于正常組（P＜0.01）。藥物干預(yù)后，各組AChRab含量均有下降，提示炙馬錢子和強的松都通過降低AChRab含量改善MG病情。強的松組和炙馬錢子高劑量組大鼠血清AChRab含量無明顯差異（P＞0.05），說明炙馬錢子降低AChRab含量效果與強的松相當。

IL-6是B細胞分化成漿細胞的關(guān)鍵因子，由Th2等多種細胞分泌，其受體廣泛表達于多種組織細胞，作為參與免疫應(yīng)答的重要炎癥介質(zhì)，在細胞因子網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮多種效應(yīng)[7]。動物研究已證實[8]，IL-6一方面可加強MHCⅡ表達，作用于活化后期的B細胞，激活I(lǐng)g重鏈啟動子大量合成分泌型Ig mRNA，從而增加抗體Ig（IgM、IgG、IgA）的分泌；另一方面可誘導(dǎo)T細胞活化、增殖和分化，促進T細胞IL-2產(chǎn)生及表達IL-2R等過程，在體液免疫和細胞免疫中發(fā)揮著重要作用。研究[9]表明，MG患者血清IL-6水平顯著高于對照組，且MG癥狀改善者其血清IL-6水平也明顯下降。說明IL-6在MG發(fā)病中起促進作用[10]。本實驗中，EAMG模型鼠血清IL-6含量相比正常組顯著升高（P＜0.01），這與大多數(shù)文獻結(jié)果一致。這可能是MG患者體內(nèi)AChR自身抗原刺激了機體免疫系統(tǒng)，使表達和分泌IL-6的AChR特異性T細胞被激活，分泌大量IL-6，并誘導(dǎo)B細胞增殖和分化，促進B細胞分化成漿細胞，產(chǎn)生大量的AChRab，導(dǎo)致MG發(fā)病。因此，IL-6通過促進AChRab的產(chǎn)生而對MG的發(fā)生、發(fā)展起著非常重要的作用。經(jīng)藥物治療后各組IL-6含量出現(xiàn)不同程度的下降，說明炙馬錢子和強的松對降低EAMG大鼠血清IL-6含量都有明確療效，而且炙馬錢子中、高劑量組比強的松組含量更低（P＜0.01）。

MG屬于中醫(yī)“痿證”范疇，該病病因復(fù)雜，多由先天稟賦不足，后天供養(yǎng)失調(diào)等因素導(dǎo)致肝脾腎功能失調(diào)而形成。病機方面，脾胃為后天之本，氣血生化之源，脾主四肢肌肉，脾虛則脾胃受納、腐熟、運化輸布水谷精微的能力不足，氣血津液生化乏源，無以濡養(yǎng)五臟六腑，肌肉筋脈失養(yǎng)，出現(xiàn)提瞼無力，四肢痿軟。肝藏血，開竅于目，主筋，為罷極之本；腎藏精，主骨，為作強之官。若肝血虧虛，血不養(yǎng)筋，罷極無本，則宗筋弛縱不能耐勞；肝血不足，精明失養(yǎng)，故見復(fù)視、斜視。另外乙癸同源，肝腎為病，常相互影響，肝血不足，可致腎精虧損；腎虛精虧，水不涵木，非惟肝腎俱虧，亦且生風動血，氣機乖亂，聚津生痰，肝風挾痰阻滯經(jīng)絡(luò)，筋脈肌肉失養(yǎng)亦致馳緩痿廢。

馬錢子味苦性寒，雖毒性強烈，但長于開通經(jīng)絡(luò)，通達關(guān)節(jié)，若炮制得宜，用量恰當，對MG有起痿振頹之效。其機制可能與士的寧能選擇性提高脊髓興奮功能，治療劑量能使脊髓反射的應(yīng)激性提高，縮短反射時間，神經(jīng)沖動容易傳導(dǎo)，骨骼肌緊張度增加，從而改善肌無力狀態(tài)有關(guān)。但馬錢子的治療量與中毒量非常接近，雖經(jīng)過浸泡、油炒、晾干、打粉、消毒等制備過程以降低毒性[11]，但超過一定劑量仍可中毒。本實驗中炙馬錢子高劑量組大鼠死亡2只，可能就與藥物濃度過高有關(guān)。因此，采用炙馬錢子治療MG時，劑量判定非常重要，一定范圍內(nèi)的高劑量藥物，能夠增強療效；反之，毒副作用也相應(yīng)增加[12]。

綜上所述，炙馬錢子能一定程度地降低EAMG大鼠血清AChRab和IL-6含量，抑制T、B細胞活化，從而減輕對突觸后膜AchR的損害，緩解EAMG病情，其作用與強的松相似，可能通過抑制免疫活化而達到治療效果，并且一定劑量范圍內(nèi)的炙馬錢子免疫調(diào)節(jié)作用更優(yōu)于強的松。

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The Immune Regulation Mechanism of Nux Vomica on Experimental Autoimmune Myasthenia Gravis Rats

ZOU Ying1,QIU Tao2,YANG Feng3. 1.Department of Clinical Psychology,the Second Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou（310005）,China;2.Department of Neurology,the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University;3.Zhejiang Chinese Medical University

Objective To investigate the immune regulation mechanism of nux vomica on experimental autoimmune myasthenia gravis（EAMG）rats.Methods Lewis rats were immunized with torpedo-derived 97-116 peptide of the AchRα-subunit in CFA.After the second immunization,the rats'weights and symptoms were observed to judge the success of the EAMG model.Rats with EAMG were divided into model group,prednisone group,nux vomica groups（low-,medium-,and high-dosage）,8 rats in each group,and were given the corresponding treatment,respectively.The levels of AchRab and IL-6 were determined by using enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）.Results The level of AChRab and IL-6 were increased in model group（all P＜0.01）.The level of AChRab in high-dose nux vomica group was lower than that in medium-and low-dosage nux vomica groups（P＜0.01）,but was not different with that in prednisone group（P＞0.05）.The level of IL-6 in medium-and highdosage nux vomica groups was significantly lower than that in prednisone group（all P＜0.01）,but there was no significant difference between high-and medium-dosage nux vomica groups（P＞0.05）.Conclusion Nux vomica can reduce the level of AChRab and IL-6 in EAMG model,inhibit the activation of T cells and B cells,so that it can reduce the damage of postsynaptic membrane AchR,and alleviate the development of EAMG.The effect of nux vomica is better than prednisone in improving immune adjustment in a certain dosage range.

rats；autoimmune myasthenia gravis；AChRab；IL-6；nux vomica；prednisone

2014-06-04

修回日期：2014-07-11

浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（No.2011ZA033）；浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（No.2012ZB050）

裘濤，E-mail：qiutao2002002@163.com