乳腺癌組織HIF-1α和Sema 4D表達及其與淋巴管密度和各臨床病理指標的關系

楊小敏潘 丹陳艷梅鄭 翔馮國飛徐曉武

1浙江省溫州市人民醫院病理科 溫州 325000 2溫州醫科大學附屬第二醫院胃腸外科

乳腺癌組織HIF-1α和Sema 4D表達及其與淋巴管密度和各臨床病理指標的關系

楊小敏1潘 丹1陳艷梅1鄭 翔1馮國飛1徐曉武2

1浙江省溫州市人民醫院病理科 溫州 325000 2溫州醫科大學附屬第二醫院胃腸外科

目的 通過檢測HIF-1α和Sema 4D在乳腺癌組織表達，探討其與淋巴管密度（LVD）和臨床病理指標的關系。方法 采用免疫組化SP法檢測110例乳腺癌組織標本HIF-1α和Sema 4D表達，檢測微淋巴管密度（LVD），依據不同臨床病理特征分組并進行組間比較，并與乳腺纖維腺瘤組織標本對照。結果 乳腺癌組織HIF-1α和Sema 4D陽性表達率分別為72.72%（80/110）和77.27%（85/110）；HIF-1α與Sema 4D表達呈正相關性（r=0.691，P＜0.01）。乳腺癌組織LVD顯著高于纖維腺瘤組（P＜0.01），淋巴結轉移組LVD顯著高于無淋巴結轉移組（P＜0.01）；pTNMⅠ～Ⅱ期組、淋巴結無轉移組癌組織HIF-1α和Sema 4D表達陽性率明顯低于pTNMⅢ期組、有淋巴結轉移組（P＜0.05，P＜0.01），不同年齡、組織學分級、腫塊大小組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。結論 乳腺癌組織HIF-1α、Sema 4D高表達，可能與淋巴管的增生、轉移侵襲有密切關系。

乳腺癌；缺氧誘導因子-1α；軸突導向因子4D；淋巴管密度

圖1 A：HIF-1α在癌細胞核表達（HE ×200）；B：Sema4D在癌細胞漿表達（HE ×200）

圖2 乳腺癌組織D2-40表達陽性的淋巴管（HE ×200）

缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是腫瘤細胞缺氧適應的中心調節因子，在多種人類惡性腫瘤早期即發現HIF-1α的過度表達，與腫瘤生長、血管形成、轉移有關[1]。軸突導向因子4D（semaphorin4D，Sema4D）是Semaphorin超家族成員之一，對腫瘤血管發生及侵襲轉移起重要作用[2]。本研究旨通過觀察乳腺癌組織HIF-1α和Sema 4D表達情況，探討其與淋巴管密度（LVD）和臨床病理指標的關系。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集2003年—2007年在我院行乳腺癌改良根治術，臨床資料齊全的女性患者110例，年齡32～68歲，平均46.4歲；術前均未行放化療及其他治療手段。所有患者的病理切片均由2位病理科醫師獨立復閱，確診110例均屬浸潤性導管癌；其中直徑＜3cm 81例，直徑≥3cm 29例；清除淋巴結數均＞15枚；腋窩淋巴結轉移63例，無腋窩淋巴結轉移47例。按國際病理學分級標準[3]：Ⅰ級30例，Ⅱ級47例，Ⅲ級33例。以同期20例女性乳腺纖維腺瘤組織標本為對照，年齡30～50歲，平均40.5歲。

1.2 主要試劑與方法 濃縮型兔抗人HIF-1α多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司，批號BA0912）、抗Sema4D單克隆抗體（BD Biosciences公司，批號610670）、濃縮液D2-40單克隆抗體（批號ZM-0465）、DAB試劑盒及SP試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。石蠟標本5μm厚連續切片，常規脫蠟。采用SP免疫組化法，按照試劑盒內說明書操作。抗HIF-1α和抗Sema4D工作液均經微波修復預處理，抗原修復液為檸檬酸緩沖液（pH6.0）。D2-40單克隆抗體工作濃度為1:100。陰性對照用PBS代替一抗。

1.3 HIF-1α及Sema4D表達結果判斷 判斷標準：以細胞核或胞漿內出現棕色顆粒為陽性信號，陽性細胞數＞20%為陽性，＜20%為陰性。

1.4 D2-40免疫組化結果判定 參照楊小敏等[4]所用方法，檢測淋巴管密度（lymphatic vessel density，LVD）。

1.5 統計學方法 應用SPSS17.0統計軟件，計量資料以（±s） 表示，采用t檢驗；計數資料比較采用檢驗或Fisher確切概率法，相關性檢驗采用Spearman相關分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌組織HIF-1α及Sema 4D表達 HIF-1α陽性信號定位于細胞核，Sema4D陽性信號定位于細胞漿（圖1，插頁）。110例乳腺癌組織HIF-1α和Sema 4D陽性表達率分別為72.72%（80/110）和77.27%（85/110）；纖維腺瘤組織未見HIF-1α、Sema 4D表達，與乳腺癌組差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.2 D2-40表達、LVD測定及與淋巴結轉移的關系

D2-40標記的微淋巴管呈棕色，壁薄無肌層，不連續，腔內無紅細胞（圖2，插頁）。癌旁組織內淋巴管較多且多呈擴張狀，癌巢內淋巴管數量較少、管腔小或閉鎖狀。纖維腺瘤組織中也可見微淋巴管，但數量少，管腔小。乳腺癌組織LVD顯著高于纖維腺瘤組（P＜0.01），淋巴結轉移組LVD顯著高于無淋巴結轉移組，差異有統計學意義（P＜0.01），見表1～2。

表1 乳腺癌組織與乳腺纖維腺瘤組織LVD值比較（±s）

表1 乳腺癌組織與乳腺纖維腺瘤組織LVD值比較（±s）

注：與纖維腺瘤組比較，*P＜0.01

組別乳腺癌組纖維腺瘤組n/例110 20 LVD 13.14±3.39* 8.25±2.55

表2 淋巴轉移組織與未轉移組織LVD值比較（±s）

表2 淋巴轉移組織與未轉移組織LVD值比較（±s）

注：與無淋巴轉移組比較，△P＜0.01

組別淋巴轉移組無淋巴轉移組n/例63 47 LVD 14.47±3.29△10.26±2.82

2.3 乳腺癌組織HIF-1α與Sema 4D表達的關系在HIF-1α表達陽性的80例乳腺癌中，Sema 4D表達陽性76例；而HIF-1α表達陰性的30例乳腺癌中，Sema 4D表達陽性9例；HIF-1α與Sema 4D及表達呈正相關（r=0.691，P＜0.01）。

2.4 乳腺癌組織HIF-1α、Sema 4D表達與LVD的關系 與HIF-1α、Sema 4D表達陰性組比較，HIF-1α、Sema 4D表達陽性組有更高的LVD（P＜0.01），見表3～4。

表3 乳腺癌組織HIF-1α表達與LVD關系（±s）

表3 乳腺癌組織HIF-1α表達與LVD關系（±s）

注：與HIF-1α陰性組比較，▲P＜0.01

組別HIF-1α陽性組HIF-1α陰性組n/例80 30 LVD 13.37±3.75▲10.80±2.99

表4 乳腺癌組織Sema 4D表達與LVD關系（±s）

表4 乳腺癌組織Sema 4D表達與LVD關系（±s）

注：與Sema4D陰性組比較，▼P＜0.01

組別Sema4D陽性組Sema4D陰性組n/例85 25 LVD 13.49±3.66▼9.88±2.37

2.5 乳腺癌組織HIF-1α、Sema 4D表達與臨床病理指標的關系 pTNMⅠ～Ⅱ期組、淋巴結無轉移組癌組織HIF-1α、Sema 4D表達陽性率明顯低于pTNMⅢ期組、有淋巴結轉移組（P＜0.05，P＜0.01）；在不同年齡、組織學分級、腫塊大小組之間差異無統計學意義（P＞0.05），見表5。

3 討論

缺氧是實體腫瘤生長的微環境特征之一；以適應這種微環境，同時增強腫瘤自身的侵襲性，腫瘤細率顯著高于pTNMⅠ～Ⅱ期組和淋巴結陰性組。因此，推測認為：乳腺癌組織中存在淋巴管的新生，腫瘤內部LVD增加有利于乳腺癌的淋巴結轉移，HIF-1α可以通過上調其下游基因Sema 4D，從而啟動激活受體c-met，使其與細胞表面的PlexinB1結合來促進腫瘤淋巴管生成及淋巴結轉移。

表5 乳腺癌組織HIF-1α、Sema4D表達與臨床病理指標的關系

總之，HIF-1α、Sema 4D表達與乳腺癌內淋巴管的增生、轉移侵襲有密切關系，進一步研究這兩種蛋白的相互作用機制，可能對乳腺癌的預后及提供新的有效治療措施有一定的臨床意義。胞會激活一系列相關分子信號傳導途徑，分泌一些重要化學介質[5]。HIF-1α是缺氧環境下被激活的重要轉錄因子，在許多實體瘤中高表達。HIF-1α下游有100多個靶基因，HIF-1α與靶基因上的低氧反應元件（hypoxic response element，HRE）相結合使得這些靶基因發揮各種各樣的功能[6]。軸突導向因子4D（Sema 4D）可通過其表面受體Plexin B1與相應的配體c-met結合來激活受體酪氨酸激酶途徑，介導腫瘤細胞遷移、侵襲和上皮細胞、內皮細胞的募集[7]，促進淋巴管生成和淋巴結轉移。既往研究表明[8]，Sema 4D在乳腺癌組織高表達，它對腫瘤血管發生有重要作用。在缺乏Sema 4D的環境中，腫瘤細胞形成腫瘤包塊及轉移的能力被嚴重的削弱[9]。Sun等[10]發現，HIF-1α可以通過上調其下游基因Sema 4D的表達，從而促進惡性腫瘤細胞生長和腫瘤內部血管生成。

本研究結果顯示，HIF-1α主要在癌細胞核表達，Sema 4D主要在癌細胞漿表達；它們在乳腺癌組中的表達陽性率大于纖維腺瘤組（P＜0.01）。HIF-1α表達與Sema 4D表達呈正相關（r=0.691，P＜0.01）。由此可見，在乳腺癌中，HIF-1α可能可以上調其下游基因Sema 4D表達。

本研究中LVD結果與即往研究相似[3，7]。與纖維腺瘤組相比，乳腺癌組織中LVD顯著增高；HIF-1α、Sema 4D陽性表達組較陰性組有更高的LVD；pTNMⅢ期和淋巴結陽性組的HIF-1α、Sema4D表達陽性

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［4］楊小敏，徐曉武，馮國飛，等.乳腺癌組織中Plexin-B1和c-met的表達與淋巴結轉移的關系［J］.現代實用醫學，2012，24（8）：889-890.

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Expressions of HIF-1α and Semaphorin 4D Protein in Human Breast Carcinoma and Their Relationship with Lymphatic Vessel Density and Clinical Pathological Indicators

YANG Xiaomin1,PAN dan1,CHEN Yanmei1,ZHENG Xiang1,FENG Guofei1,XU Xiaowu2. 1.Department of Pathology,the People's Hospital of Wenzhou, Wenzhou (325000),China;2.Department of Gastrointestinal Surgery,the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University

Objective To detect expressions of HIF-1α and semaphorin（Sema）4D in breast carcinoma and explore their correlation with lymphatic vessel density（LVD）and clinical pathological indicators.Methods The expression of HIF-1αand Sema 4D in 110 specimens of breast carcinoma were detected by immunohistochemical SP method and LVD in all specimens was measured.Different clinical pathological features were compared and breast fibroadenoma tissues were used as control group.Results The positive rates of HIF-1α and Sema 4D expression were 72.72%（80/110）and 77.27%（85/110）,respectively.HIF-1α expression were positively correlated with Sema4D expression（r=0.691,P＜0.01）.The LVD were significantly higher in breast carcinoma group than that in breast fibroadenoma group,higher in lymph node metastasis group than that in no lymph node metastasis group（P＜0.01）.The positive rates of HIF-1α and Sema 4D in pTNMⅠ-Ⅱgroup and no lymph node metastasis group were significantly lower than those in pTNMⅢ group and lymph node metastasis group（P＜0.05,P＜0.01）.No significant difference in the positive rates of HIF-1αand Sema 4D was found among different age groups,histological differentiation groups and tumor size groups（P＞0.05）.Conclusion The high expression of HIF-1α and Sema 4D in breast carcinoma may have close relationship with lymphatic hyperplasia,lymph node metastasis,and invasion.

breast neoplasms；hypoxia inducible factor-1α；semaphorin 4D；lymphatic microvessel density

2014-07-28

修回日期：2014-09-23

浙江省溫州市科技計劃項目（No.Y20100316）