養正消積膠囊對CaEs-17細胞成瘤組織及對荷瘤裸鼠生存狀態與白細胞分類的影響

符文明張愛琴范麗萍彭進文

1浙江中醫藥大學附屬第二醫院中醫科 杭州 310005 2浙江省腫瘤醫院中醫科

養正消積膠囊對CaEs-17細胞成瘤組織及對荷瘤裸鼠生存狀態與白細胞分類的影響

符文明1張愛琴2范麗萍1彭進文1

1浙江中醫藥大學附屬第二醫院中醫科 杭州 310005 2浙江省腫瘤醫院中醫科

目的 探討養正消積膠囊對荷瘤裸鼠食管鱗癌的抑制作用及對其生存狀態、白細胞計數及分類的影響。方法 食管鱗癌CaEs-17細胞株經培養并接種于裸鼠皮下，隨機分組后給予低、中、高劑量的養正消積溶液灌胃，并與順鉑對照。觀察荷瘤裸鼠生存狀況，測量腫瘤抑制率，檢測裸鼠白細胞計數及分類。結果 養正消積膠囊對荷瘤裸鼠食管癌組織具有抑制作用，對其日常生活質量、白細胞、淋巴細胞數量具有維持作用，與順鉑組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論 養正消積膠囊能抑制荷瘤裸鼠食管癌組織增殖，有利于改善其生存狀態與白細胞水平。

裸鼠；食管癌；養正消積膠囊；腫瘤抑制率；白細胞分類

圖1 模型組（HE×200）

圖2 順鉑組（15mg/kg）（HE×200）

圖3 養正消積低劑量組（1mg/kg）（HE×200）

圖4 養正消積中劑量組（2mg/kg）（HE×200）

圖5 養正消積高劑量組（4mg/kg）（HE×200）

養正消積膠囊作為抗癌新藥，目前對食管癌的體內實驗結果尚無報道。我們采用食管癌CaEs-17細胞株培養并接種于BALB/c裸鼠皮下造模，通過測量腫瘤抑制率，觀察裸鼠生存狀況，檢測裸鼠白細胞分類，發現養正消積膠囊對食管癌組織具有增殖抑制作用，有利于改善荷瘤裸鼠生存質量，報道如下。

1 實驗材料

1.1 動 物 健康BALB/c雄性裸鼠54只，體質量18～22g，購自上海西普爾·必凱實驗動物有限公司，合格證號：2008001630244。CaEs-17細胞，購自中科院上海細胞研究所。

1.2 藥 物 養正消積膠囊藥粉（規格：0.39g/粒），由石家莊以嶺藥業股份有限公司饋贈。順鉑（批號WA2A1209056，規格：20mg/支），購自齊魯制藥有限公司。

1.3 試劑及儀器 RPMI-1640培養液、0.25%胰蛋白酶，購自Gibico公司。劉A液、劉B液，購自珠海貝索生物技術有限公司。蘇木精、伊紅，購自上海善普科技有限公司。Coulter LH750全自動血細胞分析儀,購自美國貝克曼庫爾特公司。光學顯微鏡，購自日本Olympus公司。

2 實驗方法

2.1 細胞培養與造模 從液氮中取出含CaEs-17細胞株凍存管，37℃水浴中快速解凍后移入無菌操作臺內。將解凍的細胞懸液加入含有10mLD-Hanks液的離心管內，1000rpm離心5min后，移去上清液，加入RPMI 1640培養基（含有10%胎牛血清，100U/ mL青霉素、100U/mL鏈霉素）混合均勻后，放入37℃、5%CO2培養箱中進行培養。取對數生長期的CaEs-17細胞，用2mL 0.25%胰蛋白酶和0.02%依地酸消化后，收集細胞懸液，計數并調整細胞濃度為1× 107/mL細胞。全部54只裸鼠用隨機數字逐個編號，選數字最小者8只作為正常組；其余46只裸鼠按每只0.2mL標準接種CaEs-17細胞懸液于右腋皮下。接種后第7天，對接種裸鼠按序編號，每天用卡尺測量腫瘤組織的最長徑L（mm）和垂直方向的最大橫徑W（mm）1次以計算腫瘤體積V（mm3）（=L×W2/2）。第10天腫瘤體積增至100～270mm3左右。

2.2 分 組 按腫瘤體積將裸鼠分為大（201～270mm3）、中（100～200mm3）、小（＜100mm3）三組，其中腫瘤體積最小的1只，用頸椎脫臼法處死；腫瘤體積大的5只和中的40只用隨機數字分別編號后根據數字由小到大依次分成模型組、順鉑組和養正消積膠囊低、中、高劑量組，每組9只。分組次日，除模型組外，另四組分別予以順鉑腹腔注射、養正消積膠囊灌胃處理。全部裸鼠均在SPF環境中繼續飼養。

2.3 給 藥 養正消積膠囊每粒重0.39g，成人用量為每次4粒，每天3次。按《中藥藥理研究方法學》中用量折算方法，以成人用量折算成裸鼠低劑量組，得出養正消積低、中、高劑量組裸鼠每天生藥用量分別為0.02、0.04和0.08g。用生理鹽水調濃度為0.05、0.1和0.2g/mL，使每只裸鼠每天灌胃養正消積懸液用量均為0.4mL；順鉑組將20mg順鉑溶解入20mL生理鹽水中，隔日裸鼠腹腔注射0.3mL；模型組與正常組裸鼠飼養過程中不給任何藥物。給藥時間為30天。

2.4 檢測指標及方法 ①各組裸鼠的精神、活動、飲食、皮色、排便及死亡情況。并在首次及末次給藥當天各稱重1次；②末次給藥后第3天，頸椎脫臼法處死全部裸鼠并完整剝取腫瘤組織，用電子天平稱腫瘤重量并計算抑瘤率[=（模型組平均重量-治療組平均重量）/模型組平均重量×100%]；摘眼球采血法采集每組裸鼠血液送化驗室進行白細胞計數；從每個血標本中取一滴血液，編號后做血液涂片及白細胞分類。血涂片制作法：劉A液（主要含曙紅、甲醇）約0.8mL滴在血液涂片上染色30s后加劉B液（主要含亞甲藍）于劉A液上，吹耳球吹液使混和充分。2min后，自來水沖去染色液。待涂片干燥后，200倍光學顯微鏡拍照，1000倍油鏡下計數100個血細胞，找出中性粒細胞（N）、淋巴細胞（L）與單核細胞（M），并換算成百分比；③各組腫瘤組織編號后予以福爾馬林固定、石蠟包埋、切片并按說明書進行蘇木精-伊紅染色（HE染色），200倍光鏡下拍照。

2.5 統計學方法 應用SPSS16.0軟件進行統計分析。計量資料數據用均數±標準差（±s） 表示，多個樣本之間比較采用單因素方差分析，檢驗水準α=0.05。

3 實驗結果

3.1 大體觀察與病理結果 正常組裸鼠精神飽滿，活動正常，皮色光澤，飲食正常，排便未見異常，未見死亡。模型組裸鼠隨著腫瘤體積增大，飲食量增大，排便未見異常，日常活動量有所減少、精神狀態未見異常，皮色光澤，身體偏胖。順鉑組裸鼠隨著腫瘤體積增大，精神狀態明顯下降，飲食量減少，皮膚菲薄，干燥起皺，身體消瘦，其中1只死于無法進食。養正消積低、中、高劑量組裸鼠隨著腫瘤體積增大，仍精神飽滿，日常活動、飲食、排便、皮色無異常改變。低劑量組裸鼠因打架死亡1只。各組裸鼠移植瘤組織病理結果見圖1～5（插頁）。

3.2 各組裸鼠平均體質量比較 給藥前順鉑組與其余各組裸鼠平均體質量差異無統計學意義（P＞0.05）；給藥后順鉑組裸鼠平均體質量顯著低于其余各組（P均＜0.01）。見表1。

表1 各組裸鼠平均體質量比較（±s）

表1 各組裸鼠平均體質量比較（±s）

注：與順鉑組比較，*P＜0.01

組別正常組模型組順鉑組低劑量組中劑量組高劑量組n/只 劑量/（mg/kg） 平均體質量/g 898899 --1 5124給藥前23.94±1.85 23.64±1.69 23.52±1.51 23.47±1.62 23.21±1.25 23.36±1.42給藥后26.89±2.78* 27.16±1.62* 18.66±1.66 25.23±2.42* 25.80±1.46* 25.63±2.39*

3.3 各組裸鼠平均瘤重及抑瘤率比較 與模型組比較，各給藥組平均瘤重明顯下降（P＜0.05，P＜0.01）；以40%為標準，抑瘤率以順鉑組最高，其次為養正消積低劑量組，養正消積中、高劑量組未達標。見表2。

表2 各組裸鼠平均瘤重及抑瘤率比較（±s）

表2 各組裸鼠平均瘤重及抑瘤率比較（±s）

注：與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

瘤率/% --50.76 40.39 26.78 24.83

3.4 各組裸鼠血白細胞總數及分類比較 與模型組比較，養正消積低劑量組血白細胞總數（WBC）、單核細胞（M）百分比明顯增高（P＜0.05，P＜0.01），順鉑組中性粒細胞（N）百分比增高，淋巴細胞（L）百分比降低（P＜0.05）；與順鉑組比較，養正消積低、中、高劑量組中性粒細胞（N）百分比降低（P＜0.01），淋巴細胞（L）百分比增高（P＜0.01），見表3。

表3 各組裸鼠白細胞計數及分類比較（±s）

表3 各組裸鼠白細胞計數及分類比較（±s）

注：與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與順鉑組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別正常組模型組順鉑組低劑量組中劑量組高劑量組n/只898899 WBC/×109/L 6.32±1.32 7.46±1.42 8.18±0.90 9.36±2.23△8.34±2.12 9.74±1.43△N/% 50.0±11.11 67.0±14.76 79.8±4.76△△58.8±4.15** 62.8±4.87** 59.8±8.14** L/% 43.80±14.13 25.40±15.71 11.4±4.83△△27.6±3.78** 27.6±9.34** 28.2±6.87** M/% 4.2±3.77 5.8±3.19 8.8±5.81 13.6±1.82△△* 9.6±6.35 12.0±3.16△*

4 討論

目前食管癌的最佳化療方案與最佳劑量仍不明確。但一般認為，順鉑的療效比較確切[1-2]。養正消積膠囊為抗癌中成藥，由黃芪、女貞子、莪術、人參、白術、靈芝、絞股藍、土鱉蟲、半枝蓮、蛇舌草、白英、蛇莓、茵陳、徐長卿、雞內金組成。方中黃芪、人參、靈芝、女貞子、絞股藍，健脾補腎、益氣養陰以扶正，使脾腎功能健旺，發揮“養正積自消”之功；土鱉蟲、莪術逐瘀散結通絡；半枝蓮、蛇舌草、白英、蛇莓解毒抗癌以攻邪；徐長卿通絡止痛，雞內金健胃消積，茵陳舒暢氣機。養正消積膠囊的組方原則與中醫對該病的治療方法[3]基本一致。

藥物的抗癌作用是通過抑瘤率來衡量的，根據《中藥藥理研究方法學》，抑瘤率以＞40%為有效[4]。HE染色結果表明，各組裸鼠組織細胞符合惡性腫瘤細胞特點。本研究結果顯示，順鉑和養正消積膠囊均具有抑制腫瘤組織增殖的作用，以順鉑效果最佳。隨著養正消積膠囊劑量的加大，抑瘤率反而下降，此現象說明養正消積膠囊不存在劑量療效的線性關系。

癌癥的治療應重視患者的生存質量。通過觀察不同給藥方法對荷瘤裸鼠生活狀況及體質量的影響，可見順鉑組裸鼠生存質量較差，體質量下降明顯（P＜0.01），并出現裸鼠無法進食而死亡現象，而養正消積膠囊各組則無此現象。

順鉑存在骨髓抑制，胃腸道反應等副作用。而維持一定數量的白細胞對機體防御感染、消除腫瘤細胞甚至治愈腫瘤具有重要意義[5]。本研究結果顯示，順鉑有升高中性細胞數（P＜0.05）并降低淋巴細胞數（P＜0.05）的作用，而養正消積膠囊則有維持中性細胞與淋巴細胞數的作用，高、低劑量養正消積膠囊尚能增加單核細胞數（P＜0.01）；與順鉑組相比，養正消積膠囊在降低中性細胞、升高淋巴細胞與單核細胞數上存在明顯優勢（P＜0.01或P＜0.05）。這有利于維持機體的固有免疫力，有利于荷瘤裸鼠的生存。

中醫十分強調正氣在疾病治療中的作用，認為攻邪不能傷正，扶正也能消積。養正消積膠囊主要由扶正與攻邪兩類藥物組成，方中半枝蓮、白花蛇舌草、白英、蛇莓為苦寒之品，劑量倍增，更損傷正氣，反而影響總體療效。這一現象提示我們，對苦寒傷正中藥的運用應把握有度。過度化療有害，中藥過度“抗癌”也可能無益，正氣受損最終會影響抗癌療效。

［1］孫燕，石遠凱.臨床腫瘤內科手冊［M］.第5版.北京：人民衛生出版社，2012：470.

［2］Bleiberg H，Conroy T，Paillot B，et al.Randomised phase two study of Cisplatin and 5-Flurouracil versus Cisplatin alone in advanced squamous cell oesophageal cancer［J］.Eur J Cancer 1997，33（8）：1216-1220.

［3］王永炎，麟兆麟.中醫藥學高級叢書·中醫內科學［M］.第2版.北京：人民衛生出版社，2011：428-429.

［4］陳奇.中藥藥理研究方法學［M］.第3版.北京：人民衛生出版社，2011：1235.

［5］金伯泉，熊思東.醫學免疫學［M］.第5版.北京：人民衛生出版社，2010：215.

修回日期：2014-09-03

Effect of Yangzheng Xiaoji Capsules on Esophageal Carcinoma CaEs-17 Cell Tissues and the Survival Condition and White Blood Cell Classification of Mice

FU Wenming1,ZHANG Aiqin2,FAN Liping1,PENG Jinwen1. 1.Department of Traditional Chinese Medicine,the Second Hospital affiliated to Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310005),China;2.Zhejiang Cancer Hospital.

Objective To investigate the inhibitory effect of Yangzheng Xiaoji capsules on esophageal squamous cell carcinoma and its effect on the condition of survival and white blood cell（WBC）classification of rats.Methods Esophageal carcinoma CaEs-17 cells were cultivated and subcutaneously inoculated in nude mice.Mice with esophageal carcinoma were randomized into three Yangzheng Xiaoji capsule groups with different dosages（low, medium,and high）and one cisplatin group as control.The survival condition of tumor-burdened nude mice were observed.The inhibition rate of tumor was calculated.The number of WBC was determined.Results Yangzheng Xiaoji capsules inhibited the growth of esophageal carcinoma tissues of mice,and consequently improved the survival condition of mice.The number of WBC and lymphocytes in Yangzheng Xiaoji capsule groups were significantly different with that in cisplatin group（P＜0.05）.Conclusion Yangzheng Xiaoji capsules has inhibitory effect on growth of esophageal carcinoma tissues,resulting in improvement of quality of survival and keeping normal number of WBC and lymphocytes.

Nude mice；esophageal carcinoma；Yangzheng Xiaoji capsules；tumor inhibition rate；WBC classification

2014-06-02