論口腔臨床中牙周膜的再生治療

【中圖分類號】R722.12【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949（2014）10-0241-02

近年來，研究者發現，牙周膜細胞具有異質性，包含異質性細胞群，即由不同的亞型組成，細胞間存在差異，在表現型及功能上有所不同，其子代能增殖產生成纖維細胞、成骨細胞和成牙骨質細胞。這些細胞亞型可處于不同的分化階段或具有不定向的分化趨勢，牙周組織再生修復與牙周膜細胞的異質性有密切關系。

1材料和方法

1.1主要試劑和儀器。DMEM培養液、FBS（Gibco公司，美國），胰蛋白酶、二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）、地塞米松（dexamethasone，DEX）、L-抗壞血酸、beta；-甘油磷酸鈉（beta；-glycerophyosphate，beta；-GP）、消炎痛、3-異丁基-1-甲基-黃嘌呤（3-isobutyl-1-methyl-xan-thine，IBMX）、胰島素、beta；-巰基乙醇（beta；-mercap-toethanol，beta；-ME）（Sigma公司，美國），鼠抗人STRO-1多抗、鼠抗人CD146多抗（RDSystems公司，美國），CO2細胞培養孵箱（Heraeus公司，德國），超凈工作臺（蘇州凈化設備廠），低溫高速離心機（Heraeus公司，德國），倒置顯微鏡及照像系統（Olympus公司，日本）。

1.2組織塊法細胞原代培養。收集臨床上12～18歲因正畸需要拔除的牙周健康、無齲的新鮮前磨牙，拔除后立即在雙抗PBS液和DMEM液中反復清洗牙齒，刮下根中1/3牙周膜組織，剪成0.5mmtimes；0.5mmtimes；0.5mm左右的小塊。

1.3免疫細胞化學染色hPDLP的表面抗體。取生長良好的第1代細胞制備細胞爬片，用SABC法染色進行波形絲蛋白Vimentin、角蛋白Keratin、STRO-1、CD146免疫組化染色，陰性對照用PBS代替一抗，其余步驟不變，進行細胞來源及表達檢測，光鏡觀察。

1.4流式細胞表型分析hPDLP的表面標記。取對數生長期的第1～3代細胞，0.25%胰酶消化1min，1000rmiddot；min-1離心5min，棄上清液，調整細胞密度為每毫升1times；106個，PBS洗2遍，加0.02mL的FCM緩沖液（含20gmiddot；L-1牛血清白蛋白和0.1gmiddot；L-1疊氮化鈉）重懸，PE標記的STRO-1和FITC標記的CD146抗體避光4℃孵育20min，加0.2mLPBS重懸，流式細胞儀上機檢測。

2結果

2.1細胞生長情況。組織塊法原代培養的人牙周膜細胞3～6d后，可見多個組織塊邊緣有細胞開始游出，細胞形態無明顯差別，大多數為長梭形成纖維狀，1～2個突起；少數為多角形、紡錘狀或橢圓形，體積較小，胞體豐滿，生長較快，約7～14d開始匯合，以組織塊為中心呈放射狀、螺旋狀生長原代hPDLP培養10d的生長狀態倒置相差顯微鏡times；40。生長的細胞以1∶2傳代培養，最初5代的細胞培養3～5d即可長滿培養瓶瓶底，生長狀態較活躍，核分裂象多見；6～12代細胞，培養7～10d鋪滿，細胞增殖穩定。

2.2細胞表型鑒定。免疫組化顯示細胞波形絲蛋白染色陽性第1代hPDLP抗波形絲蛋白的陽性染色SABCtimes；400，角蛋白染色陰性。第1代牙周膜細胞中部分細胞抗STRO-1和CD146染色著色，細胞表達STRO-1和CD146強弱不等第1代hPDLP抗CD146染色的陽性染色SABCtimes；400第1代hPDLP抗STRO-1的陽性染色SABCtimes；400。

2.3流式細胞表型分析。流式細胞儀檢測第1～3代的hPDLP，STRO-1陽性率分別為4.23%plusmn；4.08%、1.92%plusmn；1.77%和0.44%plusmn；0.24%，LSD法比較兩兩之間差異無統計學意義（P>0.05）；CD146陽性率分別為27.20%plusmn；3.98%、18.83%plusmn；4.04%和10.61%plusmn；4.61%，LSD法比較兩兩之間差異均有統計學意義（P<0.05）。

2.4成骨誘導結果。礦化液連續培養10d左右第1代細胞呈復層生長，明顯增厚，為局灶狀，中央出現許多顆粒樣改變，并逐漸連接成片，密度增高。15d左右孔板底部出現肉眼可見的針尖大小灰白色小結節，并逐漸增大，21d后行vonKossa和茜素紅染色可見大量染成棕褐色的片狀礦化結節，周邊界限不清hPDLP礦化誘導21d后礦化結節茜素紅染色times；200。

2.5成脂誘導結果。第1代hPDLP經成脂誘導劑誘導，倒置顯微鏡下觀察，可見部分胞質內有大小不一的脂肪滴形成，經油紅O染色脂滴染成紅色第1代hPDLP成脂誘導21d后脂滴形成油紅O染色times；400。第8代牙周膜細胞經脂肪誘導，倒置顯微鏡下雖也可見細胞胞質內有脂滴形成，但形成的量要明顯少于第1代細胞第8代hPDLP成脂誘導21d后脂滴形成油紅O染色times；400。

3討論

近年來，隨著成體干細胞研究的不斷深入，采用成體干細胞作為種子細胞運用于口腔組織工程的研究逐漸展開。牙周膜干細胞同其他組織的成體干細胞一樣，目前尚缺乏特異性的表面標記對其進行鑒定和分離純化。Shi等[5]利用酶消化法通過有限稀釋法克隆化培養純化獲得PDLSC，采用直接組織塊法培養所得的細胞即為人牙周膜細胞群，首次對hPDLP和PDLSC的特性進行了對比研究，PDLSC細胞形態呈圓形或不規則形狀，周邊部細胞呈梭形或多角形，體積較小，部分細胞呈成纖維細胞狀，hPDLP主要為胞體較大的成纖維樣細胞和少量小而不規則形的細胞。hPDLP的概念逐漸明了，是含有干細胞成分的異質性細胞群，但是對其多向分化潛能的研究在國內外均少有報道。本實驗通過研究hPDLP多向誘導分化潛能，進一步探索hPDLP在體外是否具有干細胞群的特征。

本研究就hPDLP的橫向分化能力從礦化和成脂方向進行了研究，結果表明，第1～3代的hPDLP中含有一定比例的干細胞，在體外具有干細胞群的誘導分化能力。hPDLP的體外成功培養鑒定，將為后期研究牙周膜牙骨質復合體的人工生物器官的構建和牙周膜再生治療提供重要的理論依據。

參考文獻

[1]孫蕾，朱慧勇.間充質干細胞非分化性增殖的研究進展[J].國際口腔醫學雜志，2009，36（2）：235-238.

[2]金巖.組織工程學原理與技術[M].西安：第四軍醫大學出版社，2004：36-50.