扇貝多肽（WBG）對宮頸癌Hela細胞的抑制作用

【摘要】目的：探討扇貝多肽（WBG）對宮頸癌Hela細胞的抑制作用。方法：MTT法測定扇貝多肽（WBG）對Hela細胞的細胞抑制作用.結果：WBG對宮頸癌 Hela細胞有明顯的抑制效應。結論：WBG對宮頸癌 Hela細胞生長的抑制作用呈劑量依賴性，經 20-200 μM WBG處理，體外培養宮頸癌 Hela細胞生長緩慢，細胞形態發生明顯改變， 200 μM WBG時抑制率達到55.74%。

【關鍵詞】扇貝多肽，宮頸癌Hela細胞；MTT比色法；凋亡

【Abstract】Objective To investigate the WBG in cervical cancer Hela cell line. Methods To investigate WBG on the cytotoxicity of Hela cells by MTT method. Results WBG inhibit Hela cells. Conclusion WBG inhibit Hela cervical cancer cell growth in a dose dependent manner. Cervical cancer Hela cells treatment with 20-200 μM WBG in vitro slow growth， cell morphology obviously change， and the inhibition rate reached 55.74% at 200 μM WBG.

【key words 】Meretrixmeretrixpeptide；cervial cancer Hela cell；MTT colorimetry；apoptotsis

【中圖分類號】R722.12 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949（2014）10-0012-01

海洋覆蓋著地球表面積的 71%，是生命的發 源地。從海洋生物及其代謝產物中篩選和提取具有特異化學結構的天然抗腫瘤活性物質成為海洋生物活性物質開發的一個重要領域.美國 NCI每年所篩選的約30000個抗腫瘤化合物中，約 5 來自海洋生物，其中發現有抗腫瘤活性的約 1 % 1.扇貝，屬軟體動物門、雙殼綱，是我國灘涂傳統養殖的主要貝類之一.其作為一種深受人們喜愛的海洋軟體動物，具有豐富的營養價值，主要成分有：粗蛋白、粗脂肪、灰分、牛磺酸、核酸、肝糖等，此外 ，還富含 EPA和 DHA等多烯不飽和脂肪酸，以及人體易吸收的各種氨基酸和維生素等2.扇貝還有著極高的藥用價值 ，我國的眾多醫學專著 中都記載其不僅具有清熱利濕、化痰、散結的功效，對肝癌、肺癌、胃癌、甲狀腺腫等有明顯的抑制作用 ，而且還能夠發揮降血糖、降血脂，抗突變、抗衰老等多種生理功能3-4。

20世紀 60年代，Sehmeer等從扇貝抽提物中初步分離獲得一種對黑色素瘤小鼠細胞有較強抑制作用的物質，他們將這一活性物質稱為“扇素”，并指出該物質可能是分子量小于10000的多肽類物質—糖肽或小分子的核糖5.扇貝多肽（WBG）是我們提取出來的一種低分子量多肽，實驗已經證明其對肝癌和胃癌有明顯的抑制作用，并對與癌細胞生長發育有關的 SOD酶，堿性磷酸酶有激活作用，對酪氨酸酶和 N-乙酰-盧LD一氨基葡萄糖苷酶有明顯的抑制作用6-8。我們實驗中發現該多肽對體外培養的宮頸癌Hela細胞有較強的抑制作用，本文將研究探討 WBG對官頸癌 Hela細胞的抑制作用。

1 材料與方法

1. 1 材 料

扇貝多肽（WBG）由復旦大學化學實驗室提供.宮頸癌細胞株（Hela）購自上海細胞所細胞庫，由復旦大學藥學院藥理學實驗室培養傳代，3-（4，5-dimetrylthiazol）-2，5-diphenyltetrazolium bromide （MTT）和胰酶購自Sigma 公司，RPMI164培養液和小牛血清 Gibco公司；DMSO購自上海國藥試劑公司。

1. 2 主要儀器

細胞培養箱（Thermo Forma，美國Bio—Tech公司產品），超凈工作臺（Air Tech，蘇州安泰空氣技術公司產）。酶標儀為TECAN公司，型號是Infinite M200；倒置顯微鏡（OLYMPUS CKX41SF，日本Olympus公司產品）。

1. 3 WBG的配制與儲存

取 WBG9，并將其溶解于PBS緩沖液中配制成濃度為 200 mM 的母 液，0.22 μM濾膜過濾除菌 ，并以無血清培養液配制成不同濃度的作用液。

1.4 細胞培養

復蘇的宮頸癌 Hela細胞培養在 10 %小牛血清和100 U/ml 青霉素和 100 ？g/ml鏈霉素 RPMI1640培養液中，收集對數生長期細胞以1.5×104細胞的濃度接種于 100 mL細胞培養瓶，5% CO2、37℃條件下培養。

1.5 WBG抑制宮頸癌 Hela細胞的濃度效應測定

采用 Methyl thiazolyhet razolium （MTT法） 10，取對數生長期的宮頸癌 Hela細胞，配制成 2.0×104/mL單細胞懸液，接種于 96孔細胞培養板，每孔接種細胞 200 ？L，培養約 24 h后，棄去培養液 ，然后對照組每孔加入 200 ？L新鮮的完全培養液，實驗組每孔分別加入含不同濃度 WBG的培養液，WBG終濃度分別 為20、50、100、200 ？M，每個濃度重復 3次 ，在37℃，5% CO2分別培養 24 h后，棄去細胞培養液，每孔加 180 μL細胞培養液和 5 mg/mL MTT液 20 μL，繼續培養 4 h，棄細胞培養液，DMSO 200 μL/孔，37℃充分溶解后，用酶標儀（M3550型）測量吸光度，測量波長為 492 nm.按下式計算抑制率：

抑制率=對照組OD值-實驗組OD值/對照組OD值*100%

1.6 WBG抑制宮頸癌 Hela細胞的時間效應測定

胰酶消化Hela細胞，以密度為10000/well 種在96孔板里，培養2-3天，使其密度達到70-80%，換無血清培養液繼續培養12小時后，加入終濃度50 μM WBG，培養24 h后， 棄去細胞培養液，每孔加 180 μL細胞培養液和 5 mg/mL MTT液 20 μL，繼續培養 4 h，棄細胞培養液，DMSO 200 μL/孔，37℃充分溶解后，用酶標儀（M3550型）測量吸光度，測量波長為 492 nm.按下式計算抑制率：

抑制率=對照組OD值-實驗組OD值/對照組OD值*100%

1. 7 統計學方法

用 SPSS 11.0統計軟件分析數據。實驗結果均以平均數土標準差（mean ± SD）表示。多組間兩兩比較用單因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA）和Student’s t檢驗。如果P < 0.05和P < 0.01則認為組間有顯著性差異。

2 結果

2.1 WBG抑制宮頸癌 Hela細胞具有明顯的時間依賴性

實驗選用藥物作用12， 24， 48 h， 結果表明，WBG對宮頸癌 Hela細胞的抑制有明顯的時效關系，即隨著 WBG用癌細胞時間的增加，其抑制率也在明顯的增加（Figure 1）。

2. 2 WBG抑制宮頸癌 Hela細胞具有明顯的劑量依賴性

實驗選用5個濃度梯度（20，50，100和200 μM）研究 WBG抑制宮頸癌 Hela細胞的時間及濃度效應關系，結果表明，WBG對宮頸癌 Hela細胞的抑制有明顯的量效關系，即隨著 WBG用癌細胞劑量的增加，其抑制率也在明顯的增加 （Figure 2）。

2. 3 細胞形態的變化

倒置光學顯微鏡下觀察到對照組細胞平鋪貼壁生長，細胞輪廓清晰，細胞之間排列密集，呈不規則多角形，細胞問無接觸抑制，多見分裂相細胞；而經 WBG處理48 h后的細胞數量明顯減少，形態輪廓變得不清晰，細胞明顯變圓，且皺縮變形，細胞間連接減少，細胞脫壁而至懸浮狀態.核內染色質向核膜聚集并呈凝塊狀，核處于溶解狀態，光鏡結果說明，WBG能改變宮頸癌 Hela細胞形態學特征 ，并有效抑制細胞的生長。

3 討 論

惡性腫瘤是一種發病率高、嚴重威脅人類健康的疾病.隨著腫瘤分子生物學研究的不斷深入 ，人們認識到腫瘤的發生、發展是一個長期的過程，而細胞周期調控及細胞凋亡與腫瘤的發生、發展及退化密切相關.從海洋生物中尋找誘導細胞凋亡的抗癌藥物已成抗癌藥物研究的發展趨勢.另一方面，腫癌細胞具有持續分裂增殖能力 ，因此外源性物質對癌細胞增殖能力的抑制作用可以作為其抗腫瘤作用篩選指標.利用文蛤治療腫瘤在我國具有悠久 的歷史 ，我 國的《神農本 草經》《本草綱 目》、《衛濟寶書》、《傷寒論》、《方脈正宗》等著作中均 有 對 扇貝 抗 腫 癌 功 效 的 相 關 記載.Rosari Schmeer于1964年在 Science上報道了扇貝提取物具有抗腫瘤活5.張鉑等從扇貝中分離得到一種具有選擇性殺傷腫瘤 細胞功效 的糖 蛋 白 MGP050111.臺灣學者以扇貝的肝臟為原料經有機溶劑提取 ，從 乙酸乙酯部分得 2個甾醇類化合物，具有能誘導 HL-60細胞凋亡12.此外 ，許多研究報道還指出，扇貝具有提高雙向免疫調節能力13、降糖、降血脂等方面的作用14.但是國內外大多數的研究都是停留在扇貝粗提物上，對其中的主要成份以及機理沒有進一步深入的研究.我們實驗室經蒸餾水抽提，有機溶劑沉淀大分子蛋白Sephadex G-25分子篩柱層析等步驟，從扇貝體內分離提取得到一種低分子量蛋白多肽 WBG.細胞生物學效應的實驗表明，WBG對宮頸癌 Hela細胞的生長具有明顯的抑制作用，延長其倍增時間.并且隨著WBG濃度的升高、作用時間的延長 ，其抑制作用也隨之增強，呈現藥效和時效關系.我們采用光學顯微鏡方法，初步研究了WBG對體外培養的官頸癌 Hela細胞的細胞形態及其細胞周期的影響.結果發現，經 200 μM WBG作用 48 h后宮頸癌 Hela細胞的體積明顯變小，變圓，呈現皺縮變形，細胞間連接減少，貼壁率降低，部份細胞脫壁而至懸浮狀態，核內染色質向核膜聚集并呈凝塊狀，核處于溶解狀態，表明WBG可能是通過誘導細胞凋亡，實現對癌細胞增殖的抑制作用.為 WBG抗腫瘤作用及其機理的深入研究提供了重要依據，也為WBG的開發應用奠定了堅實基礎。

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