降脂消斑片對動脈粥樣硬化兔載脂蛋白A1、載脂蛋白B含量及MMP—9表達的影響

【摘要】目的 探討降脂消斑片對動脈粥樣硬化兔載脂蛋白A1、載脂蛋白B含量及MMP-9表達的影響。方法 運用高脂飼料喂養12周以造成日本大耳白兔高脂血癥合并動脈粥樣硬化模型，用降脂消斑片灌胃給藥治療4周，采用透射免疫比濁法測定血清中載脂蛋白A1、載脂蛋白B的含量；采用免疫組化法分析MMP-9在主動脈粥樣斑塊中的表達量。結果 與模型組比較，降脂消斑片能明顯降低血清中載脂蛋白B的含量，提高載脂蛋白A1含量；差異均具有顯著統計學意義（P<0.01）；同時也能明顯降低MMP-9在主動脈粥樣斑塊中的表達量，差異均具有顯著統計學意義（P<0.01）。結論 降脂消斑片通過降低載脂蛋白B的水平，提高載脂蛋白A1含量，升高ApoA1/B比值，降低MMP-9在AS斑塊中的表達，從而對動脈粥樣硬化斑塊有穩定作用，這可能是其防治動脈粥樣硬化的機理之一。

【關鍵詞】 降脂消斑片；動脈粥樣硬化斑塊；載脂蛋白A1；載脂蛋白B；MMP-9

【中圖分類號】 R285.5 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949（2014）10-0005-01

基金項目：國家“十一五”“重大新藥創制”科技重大專項（2010ZX09101—103）；省教育廳課題（編號為10C1053）；湖南中醫藥大學中醫基礎理論重點學科資助（200706）

降脂消斑片是治療高脂血癥及動脈粥樣硬化斑塊的中藥新藥，由虎杖、明礬、大黃、當歸等中藥組成，功能化痰清熱、活血通脈，具有良好的臨床療效。為進一步探討其療效機制，本研究采用兔制備動物高脂血癥合并動脈粥樣硬化模型，觀察降脂消斑片對動脈粥樣硬化兔載脂蛋白A1、載脂蛋白B含量及MMP-9表達的影響。

1 實驗材料

1.1 動物

健康日本大耳白兔40只，雌雄各半，體重（2.1±0.2 ）kg， 3月齡。實驗動物由湖南中醫藥大學實驗動物中心提供。醫學實驗動物合格證為醫動字第20～003號。實驗環境設施合格證號：醫動字第20-001號。實驗動物為單籠分裝，室溫22±4℃，相對濕度60±6%。兔用基礎飼料由湖南中醫藥大學動物實驗中心提供。

1.2 藥物

降脂消斑片采用不含輔料的干浸膏粉（每克含生藥5.12g），降脂消斑片推薦的每日臨床用量為生藥20.6g/d（長沙華源醫藥科技公司提供，批號：100920），臨用時蒸餾水溶解配制成含量為0.4mg/ml的藥液。辛伐他汀片20 mg/片，臨床推薦用量為20mg/d（上海信誼萬象藥業股份有限公司生產。批準文號：國藥準字Z19980054，批號090802）。臨用時蒸餾水溶解配制成含量為0.2mg/ml的藥液。丙基硫氧嘧啶：50mg/片（南通精華制藥有限公司，批號：110301）。

1.3 試劑

膽固醇粉（分析純，25g/瓶，上海試一化學制劑限公司，批號：091025）；豬油；蛋黃粉（陜西天斗蛋業有限公司提供，批號：100706142）；載脂蛋白A1 （ApoA1）、載脂蛋白B（ApoB）試劑盒由日本紡織株式會社公司提供；SP免疫組化試劑盒及DAB顯色劑由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.4 主要儀器

LD-A5型離心機（北京醫用離心機廠制造）；722分光光度計（上海第三分析儀器廠）；TP-1000電子天平（湘儀天平儀器廠制造）；MIAS醫學圖像分析系統（北京航空航天大學科學儀器廠制造）。JEOL-1230型電子顯微鏡（日本JEOL公司制造）；Roche/Hitach7600全自動生化檢測儀（瑞士羅氏公司制造）。

2 實驗方法

2.1 動物分組

40只日本大耳白兔適應性飼養1周，稱重，編號后，采用隨機數字表法將日本大耳白兔隨機分為正常組（10只），高脂模型組（10只），降脂消斑片劑組（10只），辛伐他汀組（10只）。

2.2 模型制備[1-2]

高脂飼料配方：膽固醇1%.豬油5%，蛋黃粉10%，基礎飼料84%。將加熱溶解后的豬油，與膽固醇、蛋黃粉與基礎飼料一起拌勻，且每100g高脂飼料中加入20mg丙基硫氧嘧啶（約按10mg？kg-1？d-1計算），并且用飼料制粒機壓制成顆粒。參照文獻[1-2]，動物稱重、編號后，除留作正常組的動物外，同時以所制備的高脂飼料持續喂養12周。本次實驗在傳統的高脂飼料配方中添加了0.2%丙硫氧嘧啶，以加速動脈粥樣硬化斑塊形成，方法為每只動物每日上午給予高脂飼料100g，下午給予普通基礎飼料50g。動物造模12周后，經抽樣檢查，證實血清血脂明顯升高，剖檢可以見到主動脈有明顯的脂質粥樣斑塊形成。表明兔高脂血癥合并動脈粥樣斑塊模型造模成功。所有實驗動物繼續喂養4周。

2.3 動物給藥

動脈粥樣硬化模型造模成功后，根據成人70kg臨床用藥量按動物體表面積計算給藥量。降脂消斑片組每日灌胃0.39g？kg-1？d-1（相當于生藥2g？kg-1？d-1）；辛伐他汀組每日灌胃1.96mg？kg-1？d-1，正常組與高脂模型組動物每日灌胃生理鹽水10ml/只/天，每組實驗動物于每日上午給食前灌胃，灌胃4周。

2.4標本采集與制備

2.4.1 血液采集

于實驗第16周末對家兔禁食12 h（不禁水），次日抽取空腹兔耳中央動脈血6mL，分置于常規非抗凝生化管中，自動平衡離心機3000 r/min離心10min，標本離心后取上層血清，分裝于-20℃低溫冰箱保存，待測：血清ApoA1、ApoB。

2.4.2 標本制備

2%戊巴比妥2mL/kg耳緣靜脈注射麻醉，取升主動脈至主動脈弓約1.5cm，DEPC處理水洗凈，置4%多聚甲醛中固定制備石蠟切片（4μm），用于免疫組織化學染色檢測。

2.5檢測指標

2.5.1 血清載脂蛋白A1（ApoA1）、載脂蛋白B（ApoB）采用透射免疫比濁法測定。

2.5.2（1）主動脈內膜中MMP-9表達含量測定采用SABC法。（2）結果判定：MMP-9免疫反應陽性物質為棕黃色顆粒，在顯微鏡圖像采集分析系統下，每組選取6張切片，每張切片隨機觀察5個視野，精確選取視野內主動脈粥樣斑塊中的所有陽性顆粒，計算機自動算出面密度。

2.6 統計學分析

采用SPSS18.0統計軟件處理，實驗數據用“ X±s”表示，先進行方差齊性檢驗，再采用單因素方差分析。若有差異進行兩組間比較LSD檢驗，若方差不齊，采用Tamhane’T2檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 實驗動物情況

實驗過程中部分動物因灌胃操作不慎造成死亡，抽樣檢測2只表明家兔高脂血癥合并動脈粥樣斑塊模型形成。最終取得完整資料進入實驗分析僅30只實驗動物，其中降脂消斑片組7只，辛代他汀組8只，模型組7只，正常組8只。

3.2 降脂消斑片對兔血清載脂蛋白A1、載脂蛋白B及 ApoA1/B的影響：各組血清中ApoA1含量的比較， 模型組血清中ApoA1含量最低，經過藥物干預，降脂消斑片組中ApoA1的水平較模型組明顯上升，與模型組比較差異具有統計學意義（F=20.80，P=0.000<0.01）。各組血清中ApoB含量的比較，模型組血清中ApoB的水平最高，經過藥物干預，降脂消斑片組中ApoB的水平較模型組明顯下降，與模型組比較差異具有統計學意義（F=174.447，P=0.000<0.01）。各組ApoA1/B比較，模型組ApoA1/B最低，經過藥物干預，降脂消斑片組中ApoA1/B升高，與模型組比較差異具有統計學意義（F=50.148，P=0.000<0.01）。辛伐他汀組也可升高ApoA1含量，降低血清中ApoB含量，結果見表一。

4 討論

脂質代謝紊亂在促進AS形成及其發展中具有重要作用。ApoAl是高密度脂蛋白中的主要蛋白，具有維持HDL-C結構的作用。ApoB作為LDL-C的主要蛋白成分，是所有血漿脂蛋白中首要致動脈粥樣硬化性脂蛋白。近年來研究表明，ApoB對脂類的代謝和轉運起著非常重要的作用，ApoB的升高是最重要的冠心病危險因素；ApoA1與動脈粥樣硬化呈負相關，ApoA1/ApoB比值與冠狀動脈粥樣硬化密切相關[3，4] 。且ApoB、ApoB/ApoA1值與冠脈病變程度關系密切，反映了動脈粥樣硬化的程度[5]。

MMP-9是一種糖蛋白，MMP-9與炎癥反應有關，多種促炎細胞因子可上調MMP-9的表達；同時MMP-9對促炎細胞因子有正反饋作用，可增強其功能[6]。促炎癥因子MMP-9（基質金屬蛋白酶-9）參與動脈粥樣硬化炎癥反應，炎癥反應能加速動脈粥樣硬化形成的進程[7]。MMP-9加劇炎癥反應，MMP-9表達的上調反映了AS斑塊的活躍程度，表明MMP-9在冠脈表達增加對急性冠脈綜合征的發生有重要意義，較高的MMP-9水平可能提示斑塊易損或破裂[8，9]。

本實驗運用高脂飼料造成日本大耳白兔高脂血癥合并動脈粥樣硬化模型。研究結果顯示，對模型動物運用降脂消斑片進行干預后，降脂消斑片可以降低載脂蛋白B的水平，提升載脂蛋白A1含量， 升高ApoA1/B比值；同時降低MMP-9在主動脈粥樣硬化斑塊中的表達量。結果表明，載脂蛋白A1及載脂蛋白B的異常、MMP-9與AS斑塊的發生、發展密切相關。MMP-9是調節細胞外基質的，雖然與炎癥反應有關，但不是主要的炎癥因子，與斑塊的穩定性密切相關。故我們認為降脂消斑片通過降低載脂蛋白B的水平，升高載脂蛋白A1含量，升高ApoA1/B比值，抑制MMP-9在主動脈粥樣硬化斑塊中的表達，從而對動脈粥樣硬化斑塊有穩定作用，這可能是其防治動脈粥樣硬化的機理之一

參考文獻

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