比索洛爾對高血壓左室肥大大鼠心肌細胞GRK2表達的影響1）

趙 婷，危小良，林岫芳，黃 茵，王成山

高血壓左心室肥厚是心血管疾病的重要危險因子，高血壓導致心肌細胞肥大、心臟重塑，最終導致心力衰竭、心源性死亡的發生，心衰引起機體交感神經的緊張性增強，β受體密度和功能下調，G 蛋白受體激酶2（GRK2）的表達和酶活性增強［1］，且在肥大心肌亞細胞結構中發現GRK2 的重新定位［2］，說明GRK2可能參與了心肌肥大時心肌細胞信號的傳導。有研究報道β受體阻滯劑影響改變心肌中GRK2的表達和活性，但缺少對心肌細胞內亞細胞結構GRK2的分析［3，4］。本研究檢測比索洛爾干預自發性高血壓心力衰竭大鼠（SHR）左心室心肌細胞中GRK2的表達及其亞細胞分布，探討比索洛爾抑制心臟肥大的機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 6月齡Wister－Kyoto（WKY）大鼠，6月、8月齡SHR 大鼠和6月齡藥物組SHR 大鼠，予喂養2個月的比索洛爾2.5mg／（kg·d）至8月齡（8M－SHR－D組），各組大鼠數為12只，均購買于成都達碩科技有限公司，藥物放于水槽中讓大鼠飲入。兔抗GRK2（C－15）單克隆抗體、辣根過氧化酶標記雞抗兔抗體、Alexa Flour 488標記牛抗兔抗體、Luminal發光試劑盒均購買于美國Santa Cruz生物技術公司，磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑均購買于美國Sigma公司，膜蛋白抽取試劑盒購買于美國Pierce公司。

1.2 實驗步驟 ①左心室組織分別提取為總蛋白、胞漿蛋白、核蛋白和膜蛋白，然后分別取這4 種蛋白上樣量25μg，應用SDS－PAGE電泳，將蛋白電轉到NC 膜上，X 線膠片曝光記錄；②將左心室冰凍切片成厚6μm 的組織片，行GRK2免疫熒光標記，并在熒光顯微鏡下觀察，將其結果與Western－Blot結果做比較。上述方法具體步驟參照文獻進行［5］。

2 結 果

2.1 各組大鼠左心室重量比較 與6M－WKY組相比，6M－SHR組的心臟重量、心臟重量與體重比以及左心室重量均明顯增加（P ＜0.05）。8M－SHR 組三項心臟重量指標進一步增加，與6M－SHR組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。與8M－SHR組相比，8M－SHR－D 組能使3項心臟重量指標明顯減少（P＜0.05）。詳見表1。

表1 各組大鼠心臟重量指標比較

表1 各組大鼠心臟重量指標比較

與6M－WKY 組比較，1）P＜0.05；與6M－SHR 組比較，2）P＜0.05；與8M－SHR 組比較，3）P＜0.05。

組別 n 心臟重量（g）心臟重量／體重（%）左心室重量（g）6M－WKY 組 12 0.78±0.03 0.31±0.02 0.39±0.02 6M－SHR 組 12 1.06±0.041） 0.36±0.011） 0.62±0.041）8M－SHR 組 12 1.21±0.072） 0.38±0.022） 0.69±0.032）8M－SHR－D組 12 0.96±0.043） 0.30±0.023） 0.52±0.023）

2.2 GRK2 在心肌組織總蛋白中表達 與6M－WKY 相比，6M－SHR心肌組織中GRK2 的表達無明顯變化（P ＞0.05）。8M－SHR心肌組織中GRK2的表達顯著增加，高于6M－SHR 組和6M－WKY 組（P ＜0.05）。比 索 洛 爾 干 預 后 的8M－SHR－D組心肌組織中GRK 2的表達顯著減少，均低于8M－SHR組（P＜0.05），但高于6M－SHR組和6M－WKY 組（P＜0.05）。詳見表2。

表2 GRK2在心肌組織中的表達

表2 GRK2在心肌組織中的表達

與6M－WKY 組比較，1）P＜0.05；與6M－SHR 組比較，2）P＜0.05；與8M－SHR 組比較，3）P＜0.05。

組別 n 總蛋白GRK2 漿蛋白GRK2 膜蛋白GRK2 6M－WKY 組 12 62.2±2.2 46.1±1.4 25.2±3.4 6M－SHR 組 12 60.7±1.9 46.8±1.7 43.9±2.61）8M－SHR 組 12 78.5±2.11）2） 58.1±0.81）2） 53.1±2.61）2）8M－SHR－D組 12 62.9±2.21）2）3）34.9±2.51）2）3） 41.8±2.41）2）3）

2.3 GRK2在心肌組織漿蛋白中的表達 與6M－WKY 組相比，6M－SHR 組心肌組織漿蛋白中GRK2的表達無明顯變化。8M－SHR組心肌組織漿蛋白中GRK2 的表達顯著增加，高于6M－SHR組（P＜0.015）和6M－WKY 組。8M－SHR－D組心肌組織漿蛋白中GRK2 的表達顯著減少，低于8M－SHR 組、6MSHR 組（P＜0.05）。詳見表2。

2.4 GRK2在心肌組織膜蛋白中的表達 與6M－WKY 相比，6M－SHR組心肌組織中GRK2 的表達顯著增加（P ＜0.05）。8M－SHR組心肌組織中GRK 2的表達進一步增加，高于6M－SHR 組 和6M－WKY 組（P ＜0.05）。8M－SHR－D 組 心肌組織中GRK 2的表達顯著減少，均低于8M－SHR組和6M－SHR組（P＜0.05）。詳見表2。

2.5 GRK2在心肌組織核蛋白中的表達 Western－Blot檢測結果顯示在分子量80kDa處未見表達條帶，提示左室心肌組織核蛋白勻漿中無GRK2的表達。

2.6 SHR 大鼠左心室組織中GRK2表達的部位及亞細胞定位的變化 熒光顯微鏡觀察發現各組大鼠心肌細胞核內均基本無GRK2綠色熒光。隨著月齡增加，心肌細胞膜（閏盤）GRK2 熒光逐漸增強，其中8M 的SHR 中心肌細胞膜（閏盤）上熒光最強，比索洛爾干預后8M 的SHR－D熒光強度變弱。進一步證實GRK2在SHR 左心室心肌細胞膜（閏盤）的聚積。

2.7 各組大鼠左心室重量與左心室組織蛋白中GRK2的相關性 左心室重量和左心室心肌組織總蛋白勻漿GRK2水平（r＝0.31；P＝0.15）、漿蛋白勻漿GRK2 水平（r＝0.42；P ＝0.082）無明顯線性相關，但與膜蛋白勻漿中GRK2 水平（r＝0.91；P＜0.001）之間呈正相關。

3 討 論

高血壓病心肌肥大是心肌細胞對多種病理刺激的一種適應性反應，涉及細胞內多條信號轉導通路的復雜病理生理過程［1］。GRK2與心肌肥大的細胞信號轉導通路有密切聯系。

本研究發現6月齡、8月齡SHR 左心室已出現GRK2在細胞膜（閏盤）聚積的表現，這與文獻報道的一致［2－5］，隨著月齡的增加，GRK2表達增加，且心肌組織總蛋白、漿蛋白和膜蛋白中GRK2，僅膜蛋白GRK2與左室組織呈正相關性。閏盤是調節肥大心肌纖維結構的重要信息交匯中心，細胞膜骨架結構上也存在多種細胞信號分子以及骨架蛋白，在GRK2和骨架蛋白相互作用的信號級聯反應事件中發揮重要的作用。研究表明P38是種有絲分裂蛋白激活酶（MAPK），參與細胞纖維重塑，GRK2調控P38活化水平，進而影響P38介導的細胞內效應［6］。這表明GRK2表達的增強以及細胞膜上GRK2的聚積與心肌細胞內多種信號因子相互作用參與心肌肥大的信號轉導。因此推測干預細胞中GRK2可能達到抑制心肌肥大的作用。

Philip等［7］報道敲除GRK2基因的大鼠不僅阻止在缺血后的心肌異常重塑，而且保存了對β受體的反應性，增強心肌收縮力。Scot等［8］也發現GRK2表達缺失的大鼠心肌對β受體激動劑的敏感性增強。Hideo等［9］對表達GRK2 阻滯劑（βARKct）轉基因鼠先予主動脈狹窄術處理后造成后負荷壓力增高，結果發現βARKct表達越強，心臟結構重塑及功能惡化程度越弱，并且保持了腺苷酸環化酶（AC）的活力和心肌細胞膜上β受體的密度。這些研究表明心肌細胞重塑與GRK2 下調心肌細胞膜上β受體的密度有關。

比索洛爾是一種選擇性的β1 受體阻滯劑，能上調β受體，在高血壓、心肌肥大、慢性心力衰竭等方面有重要的價值，但其改善心肌重塑的機制目前尚不明了。β 受體阻滯劑能改變GRK2的表達和活性，在慢性主動脈瓣反流的大鼠［4］等研究中均發現β受體信號傳導途徑受損，GRK2水平升高，β受體阻滯劑能上調β受體的密度和數量，降低GRK2水平；在人心衰研究發現β受體阻滯劑能影響右心耳中GRK2的水平［3］。但這些研究缺乏對心肌細胞亞細胞結構上GRK2 的分析。比索洛爾可以抑制左室重塑，并且心肌組織中GRK2的表達減少，GRK2在細胞膜上易位減輕。原因可能為GRK2是一種細胞溶質的酶，由胞漿易位到細胞膜實現GPCRs受體信號調節的關鍵步驟，當受激動劑刺激后，實現GRK2的細胞膜易位［10］。因此抑制心肌細胞GRK2的表達，尤其是抑制GRK2 易位于細胞膜上，可能是比索洛爾阻止心肌細胞的肥大機制之一。

GRK2參與心肌細胞肥大的信號轉導，比索洛爾可能通過干預GRK2信號途徑從而抑制心肌肥大。這從細胞和分子水平上為逆轉左心室肥大提供了新的理論和實驗依據，也為臨床防治高血壓左心室肥厚提供了新的防治思路。

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