核轉(zhuǎn)錄因子－κB在動脈粥樣硬化缺血性腦卒中模型大鼠腦組織中的表達(dá)1）

喬彬峻，段虎斌，皇甫斌，范益民，楊曉明

缺血性腦卒中（CIS）是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，其病因主要是由于腦動脈粥樣硬化（AS）致血管管腔狹窄、阻塞等導(dǎo)致腦組織缺血、缺氧、變性、壞死而引起的［1］。本研究通過檢測核轉(zhuǎn)錄因子－κB（NF－κB）在動脈粥樣硬化缺血性腦卒中大鼠腦組織中的表達(dá)規(guī)律，研究動脈粥樣硬化缺血性腦卒中的病理生理機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 成年雄性Wistar大鼠48 只，體重265 g±15g，購自山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，隨機分為對照組（8只）、AS模型組（40只），AS模型建立后又隨機分為AS 模型假手術(shù)組及AS模型持續(xù)缺血0.5h、6h、12h、24h組，每組8只。

1.2 模型建立

1.2.1 大鼠動脈粥樣硬化模型建立 對照組給予基礎(chǔ)飼料，AS模型組均給予高脂飼料（2%膽固醇、0.2%豬膽鹽、0.2%丙基硫氧嘧啶、10%豬油、87.6%基礎(chǔ)飼料）喂養(yǎng)，自由攝水。喂食量為每只每天30g～40g，整個試驗周期為6個月［2］。

1.2.2 動脈粥樣硬化基礎(chǔ)上缺血性腦卒中模型建立［3］參考Takeshi等方法制作雙側(cè)頸總動脈（2VO）結(jié)扎模型［4］。實驗前動物禁食8h，自由飲水，稱重，10%水合氯醛0.3mL／kg 進行腹腔注射麻醉，仰臥位，固定，沿頸中線切開，分離出雙側(cè)頸總動脈。對照組及AS 模型假手術(shù)組：僅作雙側(cè)頸總動脈分離，不結(jié)扎；AS 模型持續(xù)缺血組：采用外科3－0尼龍線永久結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈，于相應(yīng)時間點斷頭取腦，做免疫組化實驗。

1.3 免疫組化實驗檢測腦組織NF－κB表達(dá)情況 將所取腦組織浸入甲醛中固定，蠟塊包埋。制作石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，抗原熱修復(fù)，正常山羊血清封閉。滴加比例適當(dāng)稀釋的一抗（按1∶200稀釋，北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs－0465R），4℃濕盒過夜，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗，滴加生物素化二抗工作液，37℃孵育，PBS漂洗，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育，PBS 漂洗，DAB 顯色，常規(guī)復(fù)染，二甲苯透明，封片。

1.4 圖像分析 應(yīng)用MIAS－2000 圖像分析系統(tǒng)進行定量分析［5］，記錄免疫組化結(jié)果中的平均光密度值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間多重比較采用LSD－t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

對照組和AS模型假手術(shù)組大鼠腦組織NF－κB 免疫組化染色陽性顆粒在腦組織中有少量表達(dá)，二者比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），在AS模型持續(xù)缺血各組腦組織中有不同程度NF－κB陽性表達(dá)，且主要分布于缺血區(qū)及其周邊區(qū)。各AS模型持續(xù)缺血組與對照組比較，腦組織NF－κB 表達(dá)均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與AS模型假手術(shù)組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），各AS模型持續(xù)缺血組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表1。

表1 對照組及模型各組腦組織NF－κB表達(dá)情況 PU

表1 對照組及模型各組腦組織NF－κB表達(dá)情況 PU

與對照組及假手術(shù)比較組比較，1）P＜0.05；與AS模型持續(xù)缺血0.5h組比較，2）P＜0.05；與AS模型持續(xù)缺血6h組比較，3）P＜0.05；與AS模型持續(xù)缺血12h組比較，4）P＜0.05。

組別 n NF－κB對照組 8 6.01±0.55 AS模型假手術(shù)組 8 6.33±0.51 AS模型持續(xù)缺血0.5h組 8 7.55±0.601）AS模型持續(xù)缺血6h組 8 10.05±0.791）2）AS模型持續(xù)缺血12h組 8 16.14±0.681）2）3）AS模型持續(xù)缺血24h組 8 14.03±0.751）2）3）4）

3 討 論

缺血性腦卒中后常出現(xiàn)腦水腫，引起顱內(nèi)壓增高、腦組織繼發(fā)性損傷等，成為影響缺血性腦損傷療效的重要因素。越來越多的研究結(jié)果顯示，NF－κB的活化是缺血性腦卒中后繼發(fā)性損傷的一個重要樞紐。NF－κB是1986年Sen和Baltimore首先從B淋巴細(xì)胞核提取物中檢測出的一種蛋白因子［6］，它能與免疫球蛋白κ輕鏈基因的增強子κB序列特異結(jié)合，它也是一種具有多項轉(zhuǎn)錄激活功能的調(diào)節(jié)因子。正常情況下，大多數(shù)細(xì)胞中NF－κB與其抑制蛋白（Inhibitory Kappa B，IκB）結(jié)合形成復(fù)合體，IκB覆蓋于NF－κB的核定位信號區(qū)，復(fù)合體以非活化狀態(tài)下存在于靜止期細(xì)胞的胞漿中。當(dāng)誘導(dǎo)因子刺激時，由信號誘導(dǎo)激活的IκB激酶引起IκBa蛋白第32和36位絲氨酸的磷酸化，磷酸化的IκBQ 由泛素蛋白在多個位點形成泛素化。最后，泛素化的IκBa被26S蛋白酶水解，暴露出Rel蛋白上的核定位信號區(qū)，這樣就使NF－κB快速易位進入細(xì)胞核內(nèi)，與NF－κB的靶基因的同源序列位點結(jié)合，使這些靶基因表達(dá)增加，從而產(chǎn)生不同的基因產(chǎn)物。NF－κB轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的連接位點位于許多促炎細(xì)胞因子與免疫調(diào)節(jié)因子的啟動區(qū)，對誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)起著重要作用。NF－κB活化后，細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)在腦組織過度表達(dá)致使神經(jīng)元賴以存在的環(huán)境發(fā)生變化，使神經(jīng)元變性［7，8］。

本研究結(jié)果顯示，對照組和AS模型假手術(shù)組腦組織NF－κB表達(dá)處于低水平狀態(tài)；大鼠急性腦缺血后，腦組織NF－κB 表達(dá)顯著增強，實驗組大鼠皮層損傷區(qū)NF－κB表達(dá)0.5h即開始增高，6h明顯增高，12h達(dá)到峰值，24h開始下降；總體上，隨缺血時間延長，腦組織損傷程度也逐漸加重，損傷細(xì)胞主要以神經(jīng)元為主。本實驗使用動脈粥樣硬化基礎(chǔ)上缺血性腦卒中大鼠模型對NF－κB的表達(dá)及變化規(guī)律進行研究，更符合動脈粥樣硬化病變基礎(chǔ)上形成腦梗死的臨床實際情況。本研究結(jié)果可為缺血性腦卒中的基礎(chǔ)研究及臨床干預(yù)治療腦卒中提供新思路。

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