灘涂適生金銀花組培體系的構建與優化

李詩卉　 劉榕焱　 葉琦等

灘涂適生金銀花組培體系的構建與優化

李詩卉， 劉榕焱， 葉 琦， 李 梅， 王長海， 趙耕毛*（南京農業大學資源與環境科學學院江蘇省海洋生物學重點實驗室，江蘇南京 210095）

摘要 [目的]構建并優化灘涂適生金銀花的組培體系。[方法]以具有活力的金銀花莖段、葉芽和葉片為材料，采用混合水平的正交試驗設計，以MS為基本培養基，與不同濃度比例的NAA、IBA、6BA、KT等植物生長調節劑構成金銀花誘導愈傷組織、叢芽分化、生根的組合方案，對金銀花組織培養快繁技術開展系統研究。[結果]外植體類型影響愈傷組織的產生，葉芽的愈傷組織誘導分化率顯著高于莖段和葉片（P<0.05），誘導出的愈傷組織結構緊密。不同植物生長調節劑組合的培養基對愈傷組織的誘導率也有顯著影響（P<0.05）。愈傷組織在培養基MS+0.05 mg/L 6BA+1.0 mg/L NAA中生長良好，具備較高的分化能力。含有低濃度的生長素和分裂素的培養基MS+0.1 mg/L 6BA+0.05 mg/L NAA更有利于金銀花愈傷組織誘導叢芽分化，能夠從數量和質量上改善分化出的叢芽素質。在誘導根分化的培養基MS+0.03 mg/L NAA+1.00 mg/L IBA中，根的分化效率明顯提高，叢根更為密集，有利于擴大繁殖系數。[結論]試驗為金銀花提供了從“外植體選擇→誘導愈傷組織→叢芽分化→生根”等整個過程中優化的組培快繁體系，為耐鹽金銀花灘涂規模化種植提供了技術支撐。

關鍵詞 金銀花（FLOS LONICERAE JAPONICAE）；組織培養；愈傷組織；正交試驗

中圖分類號 S567.7+9 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2014）08-02282-04

The Construction and Optimization of Tissue Culture System of Beach Suitable Honeysuckle

LI Shihui， ZHAO Gengmao et al （Jiangsu Key Laboratory of Marine Biology， School of Resource and Environmental Science， Nanjing Agricultural University， Nanjing， Jiangsu 210095）

Abstract [Objective] To construct and optimize tissue culture system of beach suitable honeysuckle. [Method] The mature stem foliar bud and blade were used as the explants using the mixed level orthogonal experiment design， and the combining medium schemes for inducing callus， differentiation and rooting， etc. were designed with different concentration of NAA IBA 6BA KT based on the MS culture medium， and the system of tissue culture and rapid propagation of honeysuckle was studied. [Result] The results showed that the callus development was effectively influenced by explants types， and hormone concentrations of media. The callus

induction and plant regeneration of foliar bud were significantly higher than the mature stem and blades， and it also can induce callus with compact constitution. The result also showed that the culture medium with different Plant Growth Regulators combination had great effect on the inducing rate， the best medium for callus induction was MS+6BA 0.05 mg/L+NAA 1.0 mg/L. MS with low concentration of auxin and cytokinin is adapt to inducing the differentiation of tufted bud by the callus of Honeysuckle， which is MS+NAA 0.03 mg/L+IBA 1.00 mg/L. The MS， MS+NAA 0.03 mg/L+IBA 1.00 mg/L， which induce the differentiation of roots can significantly improve the inducing rate of roots， make the tufted roots more compact and improve the propagative rate. [Conclusion] A technical system of tissue culture and rapid propagation of honeysuckle involves the optimum medium of every experiment step and the operating rules（the choice of explantsthe induction of callusthe differentiation of tufted bud rooting） is provided in this study.

Key words FLOS LONICERAE JAPONICAE； Tissue culture； Callus； Orthogonal test

金銀花（FLOS LONICERAE JAPONICAE）為忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或帶初開的花，含有揮發油、黃酮類、三萜皂苷、有機酸及無機元素等，具有抑菌、抗病毒、解熱、抗炎、保肝和抗艾滋病等作用[1]。近年來，在中國逐漸被用作園林綠化觀賞、地被建設的優良材料，還是極具開發潛力的藥用、經濟植物資源，同時優異耐鹽、抗旱基因也有待開發。課題組在耐鹽金銀花前期研究基礎上，著重介紹金銀花外植體的選擇、愈傷組織培養的方法，并改良了金銀花愈傷組織誘導叢芽、叢根的培養方法，以建立完善的金銀花組培快繁體系[10]。筆者對金銀花組織培養快繁的技術進行研究，以期為耐鹽金銀花種苗產業化和規模化灘涂種植提供技術保障。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象。試驗材料為當年生金銀花莖段、葉芽和葉片，時間為春季[4]。材料選自安徽亳州。

1.1.2 主要試劑。所用試劑均為國產分析純，市售。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒處理。取金銀花莖段、葉芽和葉片，葉片切成0.5 cm×0.5 cm大小[3]，葉芽部位保留1.0 cm，莖段剪取1.5～2.0 cm[2]，振蕩洗滌后，用去離子水中浸泡15～20 min，放入超凈工作臺里，紫外燈照射5 min，無菌水震蕩洗滌1次。再用濃度75%乙醇和濃度4%次氯酸鈉消毒[8]，消毒時間如表1；無菌水沖洗6次，用無菌濾紙吸干外植體表面的水分。

1.2.2 誘導愈傷組織。以MS培養基為基本培養基，添加不同濃度的生長調節劑，共設計25種愈傷組織誘導培養基M1M25（表2）。所有培養基內均添加1.5 g蔗糖，0.35 g瓊脂，調至pH 5.8[4]。分裝于植物分化培養罐中，每罐50 ml，封口后在116 ℃條件下滅菌30 min，待培養基冷凝后，紫外線表面滅菌30 min，接種。在每種濃度處理中，每種材料接種3個罐子，每個罐子每種材料接種4個，重復3次。處理完后，組培苗均放在光照強度2 000 lx下28 ℃光照12 h/d，光照強度0 lx下25 ℃光照12 h/d的光照培養箱中培養[5]。

1.2.3 誘導叢芽分化。以MS培養基為基本培養基，添加不同濃度生長調節劑[9]，共設計24種叢芽誘導培養基Y1Y24（表3）。在無菌條件工作條件下，將長勢良好、結構緊實、質地青綠的愈傷組織塊取出，放在無菌濾紙上吸去多余水分，去除邊角褐化或玻璃化嚴重的區域，接種。在每種濃度處理中，每種材料接種3個罐子，每個罐子每種材料接種4個，重復3次。

1.2.4 誘導根分化。以MS培養基為基本培養基，添加不同濃度生長調節劑，共設計24種愈傷組織誘導培養基G1G24（表4）[6]。在無菌條件工作條件下，轉接已分化出叢芽的愈傷組織塊。在每種濃度處理中，每種材料接種3個罐子，每個罐子每種材料接種4個，重復3次。

1.2.5 試驗數據處理。將試驗中統計出來的數據按以下方法進行處理[7]：愈傷組織誘導率（%）=（產生愈傷組織總數/接種的外植體總數）×100；不定芽誘導率（%）=（產生不定芽的愈傷組織/接種的愈傷組織總數）×100；生根率（%）=（生根的不定芽數/接種的不定芽數）×100；運用數理統分析軟件IBM SPSS Statistics 20進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同類型的外植體對誘導愈傷組織的效果的影響 圖1表明，葉芽在接種后第7天，所有葉芽切口均有膨大現象，并出現顆粒狀愈傷組織。而葉片切口處有膨大現象最早是第6天，9 d后所有葉片切口具有膨大現象，15 d后有顆粒狀的愈傷組織出現。葉芽比葉片出現愈傷組織的時間早2～7 d，并且，葉芽產生的愈傷組織其生長勢明顯優于葉片。對比發現，用莖段作外植體，誘導速度明顯低于葉芽和葉片。

圖1 外植株對愈傷組織的影響

2.2 培養基內激素對誘導愈傷組織的影響 由表5可知，6BA濃度為0時，NAA是在0.80～1.0 mg/L濃度范圍內誘導效果較好，其中以濃度1.00 mg/L NAA的效果最佳，30 d內的誘導率高達88.45%。隨濃度升高誘導率下降，與NAA濃度為1.00 mg/L產生了顯著差異（P<0.05）；濃度低于0.50 mg/L，誘導效果欠佳，與NAA濃度為1.00 mg/L產生極顯著差異（P<0.01）。NAA濃度為0時，6BA的作用效果隨濃度梯度的增大而減少，為濃度0.05 mg/L 6BA與2.00 mg/L的誘導率產生了極顯著的差異（P<0.01）。

2.4 培養基內激素對誘導根分化的影響 將帶有不定叢芽的愈傷組織塊轉接到誘導根分化的培養基20 d后，帶有不定叢芽的愈傷組織均有長出不定根（表8）。

在培養基MS+ 0.03 mg/L NAA+1.00 mg/L IBA上，20 d內根的分化最多、最快，分化率高達93.30%（圖5）。NAA濃度相同時，隨著IBA濃度的變化，根分化率產生了顯著差異，隨著NAA濃度梯度遞增，分化叢根的愈傷組織塊數量總體減少，根分化率降低。

3 結論與討論

葉芽相對于葉片和莖段外植體誘導愈傷組織的速度快，成活率高。誘導出來的愈傷組織結構緊實、質地青翠。生長調節劑6BA與NAA結合使用的誘導率會高于單個生長調節劑，從而篩選出金銀花誘導愈傷組織的最佳培養基為MS+0.05 mg/L 6BA+1.0 mg/L NAA。

金銀花誘導不定叢芽的最佳培養基為MS+0.1 mg/L 6BA+0.05 mg/L NAA。低濃度的6BA不會引起細胞的過度分裂，造成幼苗葉子枯黃的現象。激動素KT會加速細胞分裂，形成稀疏泛黃的苗株，不宜施用于幼芽的愈傷組織塊。

金銀花誘導不定叢根的最佳培養基為MS+0.03 mg/L NAA+1.00 mg/L IBA，低濃度的NAA配合生長素IBA，更利于側根的形成。

參考文獻

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