水曲柳節律相關獹IGANTEA基因的克隆及同源性比對分析

蘇秋鈺　方傳雷　曹羊等

摘要

[目的]對水曲柳節律相關GIGANTEA基因的克隆及同源性進行比對分析。[方法]根據GenBank中GI基因保守結構域設計簡并引物，進行PCR分析，并與其他物種的氨基酸序列進行同源性比對分析。[結果]獲得了編碼區780 bp的部分序列，可以編碼260個氨基酸，獲得的GI基因命名為FmGI，與多個物種GI基因有著較高的同源性，其中與葡萄、大豆、苜蓿、毛果楊、蓖麻、黃瓜、菊花、大麥、玉米、小麥、擬南芥、黑麥草、洋蔥和云杉等多個物種具有較高一致性。系統發育樹分析結果表明，GI基因按照單子葉植物、雙子葉植物和裸子植物的進化關系聚為3類，明確了水曲柳GI基因的系統進化關系。[結論]該方法對水曲柳生物節律鐘GI基因編碼區進行了克隆，并對獲得的部分GI蛋白序列進行了同源性比對分析，建立了系統進化樹，為進一步獲得水曲柳GI基因全長及研究其功能起到一定參考作用。

關鍵詞 水曲柳（Fraxinus mandshurica）；GIGANTEA；生物節律；光周期；同源性分析；系統進化樹

中圖分類號 S792.12 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）08-02297-04

Cloning and Homology Analysis of Biological Rhythms Related GIGANTEA Gene in Fraxinus mandshurica

SU Qiuyu， ZENG Fansuo et al

（College of Life Sciences， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040）

Abstract [Objective] To comparatively analyze cloning and homology of biological rhythms related GIGANTEA gene in Fraxinus mandshurica. [Method] Using degenerate primers corresponding to conserved domains of GI gene in GenBank， PCR analysis was conducted， as well as homology analysis with amino acid sequence of other species. [Result] The length of the fragment obtained was 780bp， ORF predicted the protein was component of 260 amino acids. The homology analysis， of the obtained fragment showed that， it had a high consistency with Vitis vinifera， Glycine max， Medicago truncatula， Populus trichocarpa， Ricinus communis， Cucumis

sativu， Chrysanthemum seticuspe， Hordeum vulgare， Zea mays， Triticum aestivum， Arabidopsis thaliana， Lolium perenn， Allium cepaand， and Picea abies. Phylogenetic analysis showed that according to monocots， dicots and gymnosperms， the evolutionary relationship of GI gene clustered into three categories. The obtained GI gene clustered with dicots， it showed a clear phylogenetic relationship of GI gene in Fraxinus mandshurica. [Conclusion] The study provide a reference for further obtaining Fraxinus mandshurica GI gene full length and researching its functions.

Key words Fraxinus mandshurica； GIGANTEA； Biological rhythms； Photoperiod； Homology analysis； Phylogenetic tree

生物能夠通過不斷調節自身的生長和發育狀態以適應季節與環境變化。許多物種通過光周期來識別不同季節[1]。高等植物可以感受不同季節晝長的振蕩變化，并調節啟動開花進程的時間。這是環境信號和節律基因參與時間調控機制的復雜的相互作用結果[2]。生物節律基因GIGANTEA（GI）是生物鐘的重要組件，在多種植物開花時間調控中起作用[3-8]。模式生物擬南芥的研究表明，GI基因的功能是在春季和夏季等長日照通路中啟動開花[9-10]。gigantea（gi）和constans（co）等基因介導了擬南芥光周期調控通路，即其在長日照條件（LD）下響應并促進開花過程[11-12]。長日照中，生物鐘（內部計時器，調控24 h的植物節律）和節律調控開花時間基因與感受器的互作過程中，促進了CO蛋白的積累，隨后轉錄激活開花整合基因FLOWERING LOCUS T（FT）來啟動開花進程。并且，GI基因還受到生物節律鐘的調控。

生物鐘是生物內部24 h的振蕩器，調節每天的節律[13-17]。研究表明，GI的表達也受到節律基因調控，其轉錄水平在日出8～10 h后達到峰值。出峰時間、峰高和持續時間受到日照長度的影響。并且GI可以與LATE ELONGATED HYPOCOTYL（LHY），CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1（CCA1）和EARLY FLOWERING 3 （ELF3）基因相互作用，在光周期啟動的開花過程中，對開花時間相關基因起到重要調控作用[8-9]。此外，GI通過miR172調控一個與CO基因獨立的通路，并調控開花過程[18]。對于GI突變體的研究表明，GI基因在不同的生物進程中起著多效作用[19-20]。擬南芥GI基因翻譯后的蛋白預測為1 173個氨基酸，分子量為127 kDa[8-9]。與GI基因轉錄表達相似，白天GI蛋白水平也呈周期性變化，在日出12 h達到峰值；在夜間，GI與E3泛素連接酶CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENIC 1 （COP1）和時鐘相關ELF3形成了一個復合物，這個過程導致了黑暗中GI蛋白含量的下降[21]。

水曲柳（Fraxinus mandshurica）為木犀科白蠟屬（Fraxinus）植物，樹高可達30 m，胸徑可達60 cm以上，是東北林區的主要造林樹種。水曲柳是東北3大珍貴硬闊葉用材樹種之一，是闊葉樹種中適應性較強、生態價值和經濟價值較高的優良珍貴樹種[22]。筆者以水曲柳為材料，根據GenBank中GI基因保守結構域設計簡并引物進行PCR，克隆GI基因部分編碼區序列，分析水曲柳GI基因的系統進化關系，以期為深入研究水曲柳GI基因的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

研究對象。水曲柳（Fraxinus mandschurica），取材于東北林業大學實驗林場，取水曲柳新鮮葉片，液氮速凍后-80 ℃保存備用。

1.1.2

主要試劑。Primer star Taq酶、凝膠回收試劑盒、T4 DNA連接酶、JM109感受態細胞和pMD18-T載體，均購自于寶生物工程（大連）有限公司；擴增引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1

水曲柳GI基因編碼區片段的克隆。以水曲柳幼嫩葉片作為材料，應用CTAB法提取總RNA。應用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成為cDNA。根據已發表的擬南芥（Arabidopsis thaliana）、大豆（Glycine max）、玉米（Zea mays）、水稻（Oryza sativa）、車前草（Plantago）、黑麥草（Lolium perenne）、菊花（Chrysanthemum）、歐洲山楊（Populus tremula）的GI核苷酸序列，設計簡并引物（表1），以水曲柳cDNA為模板，對GI基因進行擴增。PCR擴增反應條件如下：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s；52 ℃退火30 s；72 ℃延伸90 s；共30個循環；72 ℃延伸10 min。應用凝膠回收試劑盒對特異性擴增產物回收純化，純化產物與pMD18-T載體連接，轉化克隆進入JM109感受態細胞，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.2

水曲柳GI基因的同源性比對分析。利用NCBI數據庫Blast以及PRALINE等在線分析軟件，對GI基因序列以及推測的編碼蛋白進行同源序列比對，搜索不同物種中的同源基因及蛋白。根據李軍等推薦的軟件組合[23]，先采用ClustalX將氨基酸序列進行多序列比對的分析，然后利用MEGA 5.0 軟件，算法為NeighborJoining，自檢舉1 000次，構建進化樹[24]。

2 結果與分析

2.1 水曲柳總RNA的提取

圖1表明，在提取過程中并未出現降解。利用紫外分光光度計進行濃度檢測，RNA樣品的OD260/OD280均在1.9～2.0，純度較高，能夠用于后續的反轉錄試驗。

圖1 水曲柳總RNA的提取

2.2 水曲柳GI基因編碼區片段的獲得

圖2表明，連接pMD18-T載體，轉化JM l09感受態細胞后，進行藍白斑篩選，挑取陽性克隆進行PCR檢測。將菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序驗證。獲得的水曲柳GI基因的cDNA片段應用DNAMAN軟件進行分析和預測，推測的氨基酸序列如圖3所示。

圖2 簡并引物PCR擴增產物凝膠電泳圖譜

圖3 水曲柳GI 基因cDNA序列及其推測的氨基酸序列

2.3 水曲柳GI基因編碼區片段的同源性分析

克隆后測序的結果應用NCBI網站（http： //www.ncbi.nlm.nih.gov/）BlastN和BlastX程序進行了序列和功能同源性比對分析。BlastX分析結果表明，獲得的GI基因編碼區部分片段與多個物種GI基因氨基酸序列同源，其中與葡萄（Vitis vinifera，XP_002264755.1）、大豆（Glycine max，BAJ22595.1）、苜蓿（Medicago truncatula，XP_003592047.1）、毛果楊（Populus trichocarpa，XP_002307516.1）、蓖麻（Ricinus communis，XP_002524341.1）、黃瓜（Cucumis sativus，XP_004163795.1）、菊花（Chrysanthemum seticuspe，BAM67030.1）、大麥（Hordeum vulgare，AAL08497.2）、玉米（Zea mays，AFW80282.1）、小麥（Triticum aestivum，AAT79487.1）、擬南芥（Arabidopsis thaliana，ABP96483.1）、黑麥草（Lolium perenne，CAY26028.1）、洋蔥（Allium cepa，ACT22764.1）和云杉（Picea abies，AGH20049.1）的一致性分別為69%、69%、67%、70%、68%、68%、68%、61%、59%、61%，64%、59%、59%和48%。

應用PRALINE（http：//www.ibi.vu.nl/programs/pralinewww/）在線多序列比對軟件分析對不同物種GI蛋白序列進行多序列比對分析（圖4）。結果顯示，試驗獲得的GI蛋白序列，與葡萄、大豆、苜蓿、毛果楊、蓖麻、黃瓜、菊花、大麥、玉米、小麥、擬南芥、黑麥草、洋蔥和云杉等物種GI蛋白序列相比具有很高的保守性。

2.4 水曲柳GI基因的系統進化樹的構建

系統進化樹是物種的進化史，通過構建系統進化樹可以根據這些物種的祖先描述它們的進化關系。先采用ClustalX對14個物種的GI基因的氨基酸序列進行多序列比對的分析，其中包括葡萄（Vitis vinifera，XP_002264755.1）、大豆（Glycine max，BAJ22595.1）、苜蓿（Medicago truncatula，XP_003592047.1）、毛果楊（Populus trichocarpa，XP_002307516.1）、蓖麻（Ricinus communis，XP_002524341.1）、黃瓜（Cucumis sativus，XP_004163795.1）、菊花（Chrysanthemum seticuspe，BAM67030.1）、大麥（Hordeum vulgare，AAL08497.2）、玉米（Zea mays，AFW80282.1）、小麥（Triticum aestivum，AAT79487.1）、擬南芥（Arabidopsis thaliana，ABP96483.1）、黑麥草（Lolium perenne，CAY26028.1）、洋蔥（Allium cepa，ACT22764.1）和云杉（Picea abies，AGH20049.1），然后利用MEGA 5.0 軟件，算法為Neighbor-Joining構建進化樹。圖5表明，從遺傳距離上看，這些物種的GI基因的親緣關系都比較接近，主要聚為3大類，其中被子植物中，雙子葉植物毛果楊、蓖麻、葡萄、黃瓜、大豆、苜蓿、菊花、擬南芥和水曲柳聚為1類，單子葉植物洋蔥、玉米、黑麥草、大麥和小麥聚為1類；裸子植物云杉單獨聚為1類。

3 結論與討論

植物生物節律鐘基因的研究越來越受到研究者的重視。例如，節律基因LHY/CCA1和TCO1基因參與了生物節律鐘中心振蕩器的負反饋調節循環。此外，開花時間通路的分析表明，生物節律鐘的轉錄調控作用與光的轉錄后調節作用一起可以激活響應晝長并調控開花時間的蛋白[2]。擬南芥GI基因是光周期開花通路中的核心組件。編碼蛋白定位于細胞核，是植物特異性蛋白，在CO基因上游起作用。GI的mRNA上下的振動受到晝夜節律的調控，在日出8～10 h后含量達到峰值，但是GI基因同時會反饋調節生物鐘，維持晝夜的正常節律。擬南芥gi突變體中CO基因的表達下降了，而GI基因的過表達可以增加CO的mRNA表達水平，并可以促進植物在短日照（SD）條件下開花。gi突變體的在連續光照或黑暗下，其常規晝夜節律會被擾亂，并且延遲起作用[25-26]。

試驗利用GenBank上已發表的GIGANTEA（GI）基因的氨基酸序列，設計簡并引物，對水曲柳GI基因進行擴增，獲得了編碼區780 bp的部分序列。經過分析發現其可以編碼260個氨基酸。獲得的GI基因序列與多個物種GI基因有著較高的同源性，其中與葡萄、大豆、苜蓿、毛果楊、蓖麻、黃瓜、菊花、大麥、玉米、小麥、擬南芥、黑麥草、洋蔥和云杉等一致性分別為69%、69%、67%、70%、68%、68%、68%、61%、59%、61%，64%、59%、59%和48%。對其氨基酸序列的比對分析發現，獲得的GI蛋白序列與其他物種的同源性也較高。進化樹的結果表明，GI蛋白家族保守性較高，大體按照單子葉植物、雙子葉植物和裸子植物的進化關系分為3類。試驗獲得的水曲柳GI部分氨基酸序列，也與雙子葉植物毛果楊、蓖麻、葡萄、黃瓜、大豆、苜蓿、菊花和擬南芥聚為一類，符合進化關系。

試驗對水曲柳生物節律鐘GI基因編碼區進行了克隆，并對獲得的部分GI蛋白序列進行了同源性比對分析，建立了系統進化樹，對進一步獲得水曲柳GI基因全長及研究其功能起到一定參考作用。

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