鹽脅迫對桑葉中1脫氧野尻酶素含量的影響

丁俊男　遲德富

摘要 [目的]考察鹽脅迫對桑葉中1脫氧野尻酶素含量的影響。[方法]以黑龍江省桑樹品種青龍桑為試驗材料，采用不同鹽濃度下對桑苗進行鹽脅迫處理，利用高效液相色譜測定1脫氧野尻酶素的含量。[結果]不同濃度的NaCl脅迫下桑樹葉片的1脫氧野尻酶素含量均高于對照，其中50 mmol/L NaCl溶液處理下桑樹葉片中1脫氧野尻酶素含量在第31天達到最大值，為1.51 mg/g；并且，在NaCl脅迫下桑樹上部葉的1脫氧野尻酶素含量大于下部葉。[結論]適當的鹽濃度能有效提高桑苗葉片中1脫氧野尻酶素的含量。

關鍵詞 桑樹（Morus alba L.）；鹽脅迫；1脫氧野尻酶素；含量測定；高效液相色譜

中圖分類號 S888.2 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）08-02315-03

Effects of Salt Stress on 1DNJ Content in Mulberry Leaf

DING Junnan， CHI Defu

（College of Life Science， Northeast Forest University， Harbin， Heilongjiang 150040）

Abstract [Objective] To investigate effects of salt stress on 1DNJ content in mulberry leaf. [Method] With Heilongjiang mulberry variety Qinglongsang as test material， different concentration salt stress treatments were conducted. HPLC method was used to determine 1DNJ content. [Result] The results showed that the DNJ contests of mulberry is higher than CK under the salt stress， and 50 mmol/L NaCl mulberry leaf in solution with DNJ contents reach maximum 1.51 mg/g after 31 days. Under NaCl stress， 1DNJ content in upper leaves of mulberry is higher than that of the lower leaves. [Conclusion] The appropriate salt concentration can effectively improve 1DNJ content in mulberry leaf.

Key words Mulberry； Salt stress； 1 Deoxynojirimycin； Content determination； High performance liquid chromatography

桑屬植物桑（Morus alba L.）作為傳統中藥始載于《神農本草經》，在我國已有數千年的栽培歷史，根皮、枝葉、果實等皆可入藥，具有重要的藥用價值[1]，特別是近年來桑樹中1脫氧野尻霉素（1deoxynojirimycin，DNJ）的研究引起國內外注意。其化學結構與α1，4葡萄糖類似，具有降血糖的作用，在糖尿病、肥胖癥和病毒感染等疾病方面顯示出明顯藥理作用[2]。DNJ是植物的次生代謝產物，是植物對環境適應而產生的代謝產物，也是植物防御逆境災害的防御機制之一，在調節植物與生態環境的關系中起一定作用。很多植物次生代謝物都有治療疾病的功能，也是醫藥產品和化學產品的來源[3-7]。許多藥用植物在受到外界刺激后，能夠明顯提高甚至合成很多藥用次生代謝產物，并且這些藥用物質還會有化學防御作用的物質，通常稱之為植保素（phytoalexin）。DNJ在干旱、鹽堿和低溫等逆境條件下能有效的積累。對于植物體本身而言，DNJ的積累主要用于自身對逆境的防御，還可用于藥物的開發。目前，有關桑樹不同種類、不同品種、同一品種的不同器官和不同生長季節的DNJ含量測定和變化已有很多研究[8-11]，如：施氮量和氮素形態[12]、光照[13]等對桑樹葉片中DNJ含量均有影響。鹽脅迫是限制植物生長發育的重要因素[14-15]，特別是目前我國北方地區桑樹的推廣主要集中在鹽堿化程度較高的廢棄用地，但目前有關鹽脅迫對桑樹葉片中DNJ含量的影響方面的研究鮮有報道。為此，筆者探討不同濃度NaCl脅迫對桑樹葉片中DNJ含量的影響，以期為提高桑樹DNJ的含量及藥用價值提供理論依據，并為指導藥用桑樹的合理推廣栽培提供一些基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

研究對象。供試桑樹（Morus abla L.），品種為2年實生桑苗“青龍桑”，由黑龍江省蠶業研究所提供。

1.1.2

主要儀器。Agilent 1100型高效液相色譜儀，購自Agilent公司。

1.1.3

主要試劑。DNJ標準品和芴甲氧基酰氯（FMOCCl），購自Sigma公司；乙腈和甘氨酸為色譜純，購自天津基準試劑有限公司；其余試劑均為分析純，市售。

1.2 方法

1.2.1

色譜條件。色譜柱為C18柱（Hypersil GOLD）；流動相為乙腈-醋酸（55∶45，V/V）；流速為1.0 ml/min；柱溫25 ℃；紫外檢測器激發波長為254 nm。

1.2.2

樣品的初處理。試驗于2013年7月在東北林業大學分子生物學實驗室進行。2013年5月選取長勢一致的桑苗種于35 cm×40 cm的培養缽中，每缽定植一株。選擇長勢相對一致的30株苗作為試驗用苗，于2013年7月1日開始控水5 d，第6天進行鹽脅迫處理，各處理分別澆灌濃度為50、100、150、200和250 mmol/L的NaCl溶液，以正常澆水處理為對照，每個處理設5株重復。每個培養缽下放置塑料托盤以防止鹽分流失，每隔2 d澆鹽溶液1次，每次澆灌1 000 ml。每次澆灌前采集桑樹上部葉（1～5葉位）及下部葉（6～10葉位），采收的葉片立即殺青（105 ℃，30 min）后烘干（80 ℃，30 h）至恒質量，烘干的樣品經粉碎機粉碎后過80目篩，放入-80 ℃冰箱保存備用。

1.2.3

樣品的提取。各取不同鹽處理桑葉粉0.200 g于2 ml離心管中，加入0.05 mol/L HCl溶液1.0 ml，渦旋混合2 min ，超聲波處理40 min，于12 000 r/min離心30 min，收集上清液，沉淀物再按上步重新提取一次，合并2次上清液，定容至2 ml，即得樣品提取液。每個處理3個重復。

1.2.4

對照品溶液的制備。精密秤取5.0 mg DNJ標準品于容量瓶中，加入500 ml濃度0.05 mol/L HCl溶液，搖勻即得DNJ標準母液；用蒸餾水將母液配制成1、10、20、30、40、50和60 μg/ml系列標準溶液。

1.2.5

方法學考察。（1）系統適應性試驗。取適量對照品溶液和樣品溶液，按照“1.2.1”中色譜條件進樣，記錄色譜圖，考察系統適應性。（2）線性關系的考察。取制備的系列標準溶液，分別按照“1.2.1”中色譜條件進樣，以DNJ濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸，計算線性回歸方程。（3）穩定性試驗。將桑樹葉片的待測液放置于溫室條件下，進行衍生化處理之后，分別于0、1、2、4、6、8、12、14和16 h 測定峰面積，利用DNJ標準品濃度和色譜峰面積之間的擬合方程，計算DNJ含量的RSD。（4）重現性試驗。精密稱取桑葉樣品6份，衍生化處理后，進行HPLCUV測定，計算DNJ含量及RSD。（5）加樣回收率試驗。精密稱取已知含量DNJ的桑樹樣品5份，加入DNJ標準品，衍生化處理后，經HPLCUV測定，計算平均加樣回收率和RSD。

1.2.6

衍生化處理。取100 μl待測樣品提取液于2 ml離心管中，加入200 μl pH 8.5的0.4 mol/L硼酸鉀緩沖液，然后加入250 μl濃度5 mmol/L的FMOCCl（溶于50%的乙腈中）溶液，渦旋混合，于25 ℃恒溫水浴箱中反應20 min，加入1 mol/L甘氨酸50 μl中和剩余的衍生化試劑FMOCCl，再加入50 μl體積分數為1%的醋酸溶液，用水定容至刻度；最后用0.45 μm針頭過濾器過濾，即可進行HPLCUV檢測。標準品溶液衍生化步驟同上。取10 μl進樣分析。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

（1）系統適應性試驗。圖1表明，在DNJ標準樣的色譜圖中含有3個吸收主峰，峰1為DNJFOMC，峰2為GLYFMOC，峰3為FMOCOH。待測樣品中DNJ與相鄰組分之間得到了較好的基線分離。在DNJ衍生化處理中，加入試劑芴甲氧基酰氯（FMOC）后的水解副產物FMOCOH和GLYFMOC均不干擾分析組分的測定。（2）線性關系的考察。以DNJ標準品的濃度（X）和色譜峰面積（Y）繪制標準曲線，并進行線性擬合，得到DNJ濃度與色譜峰面積之間的線形回歸方程為：Y=265.17X17.53，R=0.994 6。試驗結果表明，在1～60 μg/ml范圍內，DNJ濃度與色譜峰面積的線性關系良好。（3）穩定性試驗。計算得DNJ含量的RSD為4.01%，表明待測液DNJ在16 h之內基本穩定。（4）重現性試驗。計算得DNJ的平均含量為0.861，RSD為2.5%（n=6），表明方法重現性良好。（5）加樣回收率試驗。由表1可知，平均加樣回收率為90.9%，RSD為2.3%，表明該方法準確可靠，可用于桑葉中1脫氧野尻酶素的含量測定。

2.2 鹽脅迫對桑樹DNJ含量的測定

圖2表明，對照組桑樹葉片中的DNJ含量始終維持在0.6～0.8 mg/g，不同濃度鹽脅迫下桑樹葉片中的DNJ含量均明顯高于對照。在濃度50 mmol/L的NaCl脅迫下，桑樹葉片中的DNJ含量積累表現明顯，并且在31 d時達到最大值1.51 mg/g，平均含量為1.11 mg/g。濃度100、150、200和250 mmol/L的NaCl脅迫下桑樹葉片中的DNJ含量表現出相同的變化規律，均在處理第21天時達到峰值，分別為1.48、1.29、1.20和1.09 mg/g，并且隨著NaCl濃度的增加，桑樹葉片中DNJ含量的峰會逐漸降低，脅迫處理21 d后隨著脅迫時間的延長，各處理桑樹葉片中DNJ含量均呈降低趨勢。

2.3 鹽脅迫下桑樹上部葉與下部葉DNJ含量的測定

圖3表明，在整個試驗過程中各濃度鹽處理的桑葉取上部葉和下部葉進行DNJ含量的測定，結果表明桑樹上部葉DNJ含量均大于下部葉含量，其整體DNJ含量變化呈現從升高到降低的趨勢，上部葉與下部葉的平均含量分別為0.88和0.75 mg/g。

3 結論與討論

植物對任何環境的適應都會誘導產生一些形態剖析，物候與生理上的變化[16-17]。適宜的鹽度不僅能促進植物的營養生長，而且能促進植物的營養生長，而且能促進某些鹽生植物的開花與果實發育。鹽脅迫幾乎影響植物所有的重要生命過程，如生長、光照、蛋白合成、能量和脂類代謝[18]。通過試驗可知，鹽脅迫下桑樹葉片中1脫氧野尻霉素（1DNJ）均有不同程度的增加，在鹽濃度不斷積累的情況下呈現出先上升在下降的趨勢，并且其總平均含量大于對照。試驗還對桑樹上部葉與下部葉DNJ含量進行了對比，結果表明上部葉DNJ含量大于下部葉含量，有研究表明桑樹上部嫰葉DNJ含量大于下部成熟葉是一種化學防御機制。根據C/N平衡的假設（CNB）可推斷出植物在貧瘠的土地上，形成次生代謝產物是一種防御機制。由此可見，適當的鹽濃度對桑樹DNJ含量的積累有積極作用，DNJ作為一種次生代謝產物，桑樹葉片中的DNJ含量在鹽脅迫下的大量積累可能具有一些其他的生理功能，有待更進一步的研究。生物堿作為一類重要的次生代謝產物，具有明顯生理生物活性，當外部生態環境改變和動物取食時，生物堿可作為一種植物保護劑。在試驗過程中，鹽脅迫使土壤中的水勢下降，造成桑苗的水分虧缺的生理干旱狀態影響生長，當試驗進行19～21 d時，各試驗組的桑苗均出現桑葉變黃，葉片脫落，桑苗對100～250 mmol/L的NaCl高度敏感。

參考文獻

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