HPLC法測定白蠟樹葉中秦皮甲素含量

孫亞偉　 孫豐潤

摘要 [目的]測定白蠟樹葉中秦皮甲素的含量。[方法]樣品經無水甲醇回流提取，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-濃度0.1%磷酸溶液（8∶92，V/V）為流動相，檢測波長334 nm，柱溫30 ℃，流速1.0 ml/min，采用高效液相色譜法測定含量。[結果]平均回收率為96.59%，RSD為2.39%（n=6）；白蠟樹葉中秦皮甲素的平均含量為0.155 9 mg/g。[結論]該方法穩定性好，精密度高，重現性好，可用于白蠟樹葉中秦皮甲素的含量測定。

關鍵詞 秦皮甲素；白蠟樹葉；HPLC；含量測定

中圖分類號 O657.7；S567 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2014）08-02327-03

木犀科植物白蠟樹（Fraxinus chinensis Roxb.）在我國分布廣泛。其枝皮作為中藥秦皮入藥，一般采用取枝剝皮或刨樹剝皮的辦法獲取。秦皮具有清熱燥濕、收澀止痢、止帶和明目的功效，主要用于治療濕熱瀉痢、赤白帶下、目赤腫痛和目生翳膜等癥。秦皮中的主要活性成分是秦皮甲素（Aesculin）和秦皮乙素（aesculetin）。多種治療腸炎、單純皰疹病毒性角膜炎的中成藥均以秦皮甲素含量作為質量控制指標。秦皮甲素還對試驗性脂肪肝有一定的防治作用[1]；可抑制人肺癌細胞H125體外增殖，誘導細胞凋亡[2]。每年秋季有大量的白蠟樹葉脫落而得不到利用，為了從自然界獲取更多的藥用資源，又不破壞植被，筆者對白蠟樹葉中的秦皮甲素含量進行測定，以期為白蠟樹葉的合理開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象。白蠟樹葉，于8月中旬采自山東濱州市城區，經濱州醫學院孫豐潤教授鑒定為白蠟樹（Fraxinus chinensis Roxb.）的樹葉。

1.1.2 主要儀器。Agilent 1260 HPLC儀（DAD檢測器和Agilent 1260工作站），購自Agilent公司；AE240電子分析天平，購自瑞士METTLER公司；CQ250超聲波清洗器，購自上海超聲波儀器廠；玻璃儀器用超聲波清洗器清洗1 h，用超純水洗凈后烘干備用。

1.1.3 主要試劑。秦皮甲素，購自中國藥品生物制品檢定所，批號：748701；秦皮乙素，購自中國藥品生物制品檢定所，批號：110741200506；乙腈為色譜純，購自山東禹王實業有限公司化工分公司；甲醇為色譜純，購自天津市科密歐化學試劑有限公司；硅膠G薄層板，購自青島勝海精細硅膠化工有限公司；三氯甲烷、甲酸和乙酸乙酯均為分析純，市售。

1.2 方法

1.2.1 薄層層析。

1.2.1.1 對照品溶液的制備。分別取適量秦皮甲素對照品、秦皮乙素對照品，加無水甲醇制成每1.0 ml各含2.0 mg的溶液，作為對照品溶液。

1.2.1.2 供試品溶液的制備。取1.000 g干燥的白蠟樹葉粉末，加乙酸乙酯10 ml，浸泡1 h，超聲15 min，濾過，濾液揮干，加5 ml無水甲醇溶解，過濾，取濾液作為供試品溶液。

1.2.1.3 薄層層析。吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-無水甲醇-甲酸（6∶1∶0.5，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。

1.2.2 含量測定。

1.2.2.1 對照品溶液的制備。精密稱定2.50 mg秦皮甲素，3.91 mg秦皮乙素，以無水甲醇溶解，并分別定容至50 ml的容量瓶中，備用。

1.2.2.2 樣品溶液的制備。精密稱取1.590 g干燥的白蠟樹葉粉末（過3號篩），置具塞錐形瓶中，精密加入50 ml無水甲醇，密塞，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用無水甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

1.2.2.3 色譜分析條件。以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-濃度0.1%磷酸溶液（8∶92，V/V）為流動相，檢測波長334 nm，柱溫30 ℃，流速1.0 ml/min，進樣量10 μl。

1.2.2.4 方法學考察。（1）系統適應性試驗。吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μl，在上述色譜條件下進行測定，考察系統適應性。（2）線性關系的考察。分別精密吸取秦皮甲素對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 ml分別置10 ml量瓶中，用無水甲醇稀釋至刻度，搖勻；分別精密吸取10 μl，注入高效液相色譜儀，以進樣量X（mg）為橫坐標，峰面積Y為縱坐標繪制標準曲線，計算線性回歸方程。（3）穩定性試驗。精密吸取0.01 mg/ml濃度的對照品溶液各10 μl，分別于1、2、4和6 h時進樣，測定峰面積積分值，計算峰面積積分值的RSD。（4）精密度試驗。精密吸取0.01 mg/ml濃度的對照品溶液各10 μl，重復進樣5次，計算峰面積的RSD值（5）重現性試驗。按樣品溶液制備方法平行制備樣品溶液5份，每份取10 μl，按“樣品測定”方法測定峰面積，計算RSD。（6）加樣回收試驗。取已知秦皮甲素含量的白蠟樹葉，按“樣品溶液制備”方法制備樣品溶液，在無水甲醇補足減失的重量前，精密添加對照品溶液2.0 ml，混勻，精密吸取上述溶液10 μl進樣，測定回收率（n=6），計算平均回收率和RSD。

1.2.2.5 樣品的含量測定。取適量供試品溶液，按照“線性關系”方法，對樣品進行含量測定，通過標準曲線計算白蠟樹葉中秦皮甲素含量。

2 結果與分析

2.1 薄層分析 圖1表明，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。白蠟樹葉在秦皮乙素相應的位置上斑點不明顯；以同樣方法對白蠟樹翅果進行試驗，未檢出秦皮甲素、秦皮乙素斑點。

2.2 方法學考察 （1）系統適應性試驗。圖2表明，供試品溶液和對照品溶液在此條件下分離效果良好。而樣品溶液中秦皮乙素含量極低，因此不再進行含量測定。（2）線性關系的考察。計算得線性回歸方程為：Y=1 627.50X+142.89，R為0.998 0。試驗結果表明，在0.025 0～0.250 0

素濃度與峰面積的線性關系良好。（3）穩定性試驗。計算得峰面積積分值的RSD為1.06%，表明指標成分在6 h內比較穩定。（4）精密度試驗。計算得峰面積的RSD為1.15%，說明條件精密度良好。（5）重現性試驗。計算得峰面積的RSD為1.23%，表明方法重現性良好。（6）加樣回收試驗。由表1可知，平均回收率為96.59%，RSD為2.39%（n=6），表明該方法準確，可靠，可用于白蠟樹葉中秦皮甲素的含量測定。

2.3 樣品的含量測定 由表2可知，白蠟樹葉中秦皮甲素

3 結論與討論

最新版中國藥典規定，秦皮中秦皮甲素和秦皮乙素的總量，不得少于1.0%[3]。而白蠟樹葉中秦皮甲素含量只有0.016%，秦皮乙素含量更低，因此，白蠟樹葉不可作為秦皮代用品。隨著天然藥物提取技術進步，提取成本降低，白蠟樹葉可作為工業原料用于秦皮甲素的提取。

木犀科植物中與白蠟樹近緣植物的根、樹皮中秦皮甲素和秦皮乙素定性、定量測定已有諸多報道，其中左月明等報道了苦櫪白蠟樹（Fraxinus rhynchophylla Hance）、宿柱白蠟樹（Fraxinus stylosa Lingelsh）葉中秦皮甲素的含量[4]，而關于白蠟樹（Fraxinus chinensis Roxb.）葉中秦皮甲素定性、定量測定的研究鮮有報道。試驗參照最新版中國藥典方法測定，方法科學、簡便，穩定性好，實用性強。

秦皮甲素和秦皮乙素為香豆素類化合物，在自然界中分布廣，生物活性明確，試驗只是初報，其在白蠟樹不同部位、不同采集時間與含量的變化規律還要進一步探討。魯北地區多鹽堿地，可供種植的植物種類少，而白蠟樹在魯北地區長勢良好，在不破壞植被的情況下，充分利用落葉資源，又可以保持環境衛生，有利于區域經濟發展。

參考文獻

[1]

李小華，孫毅毅.秦皮甲素對高脂飲食誘導的大鼠脂肪肝的防治作用[J].中國新藥與臨床雜志，2010，29（9）：679-683.

[2] 王晶. 秦皮甲素對人肺癌細胞H125體外增殖的影響[J].時珍國醫國藥，2011，22（2）：507-509.

[3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].北京：中國醫藥科技出版社， 2010：254.

[4] 左月明，王振月，崔紅花，等. 不同地理種源秦皮的樹皮及葉中秦皮甲素、秦皮乙素的含量測定[J].中成藥，2003，25（7）：36-38.