兔耳廓軟骨的體外培養及細胞特性研究

謝波 馮娟娟 馬夢婷等

摘要 [目的]研究軟骨發育與重建，建立軟骨體外培養模式，[方法]通過改良組織塊細胞培養法，進行家兔耳廓彈性軟骨細胞的體外培養，研究其形態與生長特性。[結果]兔耳軟骨組織16 h完成貼壁，1.5 d軟骨細胞遷出，144 h細胞生長達到融合；傳代兔耳軟骨細胞12 h貼壁，生長特性與原代相似，但第3代細胞的延滯期長，在培養48 h開始進入對數期，培養第8天細胞數量達到峰值。HE染色結果表明彈性軟骨細胞形態均勻，細胞呈圓形或橢圓形，核呈橢圓形，可見雙核或多核現象。軟骨陷窩和核深染，胞漿著色均勻。細胞分裂旺盛。同族細胞群清晰。[結論]原代及2代耳軟骨細胞體外生長特性及細胞形態一致，培養條件穩定。

關鍵詞 彈性軟骨；改良組織塊法；體外培養；細胞特性

中圖分類號 S829.1 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）08-02323-03

Culture in vitro of Rabbit Auricular Cartilage and Its Cell Characteristics

XIE Bo， GAO Qinghua， WANG Shanshan，et al （College of Animal Science， Tarim University， Alar， Xinjiang 843300； College of Life Sciences， Tarim University， Alar， Xinjiang 843300）

Abstract [Objective] The research aimed to study the development and reconstruction of cartilage and establish in vitro cultivation mode of cartilage. [Method] The elastic cartilage cells of rabbit auricle were cultured in vitro by using modified tissue block cell culture method. And their morphological and growth characteristics were studied. [Result] The cartilage tissue of rabbit auricle adhered to wall within 16 h and cartilage cells fell off after 1.5 d， the cells grew and fused after 144 h. The generated cartilage cells of rabbit auricle adhered to wall within 12 h and their growth characteristics were similar with the primary generation. The third generation of cells had a long lag phase， entered into the logarithmic phase after culturing 48 h and the cell number reached the peak value on the eighth day. HE staining results showed that the configuration of elastic cartilage cells was uniformed， the cells were round or oval and their cores were elliptical. Dual-core or multi-core phenomena were seen. The cartilage lacuna and nuclear were stained， and the staining of cytoplasm was uniformed. Cell division was very vigorous. The same family of cell populations was clearly seen. [Conclusion] The primary and two generations of rabbit auricle cartilage cells had consistent growth characteristics and cell morphology and stable culture conditions.

Key words Elastic cartilage； Modified tissue block； Culture in vitro； Cell characteristics

彈性軟骨僅存在高等動物外耳廓、聽道、會咽等處。與其他軟骨相比，間質中含有大量交織成網的彈性纖維，成網狀在軟骨內排列，同時含少量膠原纖維。目前，彈性軟骨大多被用于修復人類殘缺及畸形耳廓及其他美容修復[1]。另外，還被用于透明軟骨的修復。MATEV GORENEK等[2]以兔耳軟骨為材料，成功體外培養后移植到兔腰椎間盤，研究自體軟骨移植方式對人類腰椎間盤進行性退化的治療效果，結果發現用耳彈性軟骨移植至6周后在髓核處有類透明軟骨組織產生，而在腰椎間盤處的軟骨基質中未發現彈性軟骨的細胞。Mizuno M等[3]用同樣的方法用將狗的耳彈性軟骨移植到其受傷的膝關節處，結果發現移植的彈性軟骨細胞能夠重塑透明軟骨，為人類關節進行性退化疾病找到很好的解決方法。由此可見，彈性軟骨對關節透明軟骨的重建和修復有重要意義。

目前我國對彈性軟骨的體外培養開始于2000年。張金寧等體外培養了獼猴耳軟骨，并分析了體外環境下軟骨細胞的代謝功能。溫葉飛[4]、常慶[5]、蔣欣泉[6]和謝波[7]分別利用豬、羊和兔的耳廓軟骨進行體外培養。冉鵬[8]對人耳廓軟骨進行了體外培養，認為體外培養的人耳軟骨細胞生物學特性不依賴年齡，體外培養的第1代和第2代人耳軟骨細胞可作為耳軟骨組織工程研究的種子細胞。

基于此，筆者利用兔耳廓軟骨作為材料，通過體外培養觀察彈性軟骨細胞在離體情況下的生長狀態及特性，確定生長條件，以期為彈性軟骨體外工程組織研究提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 2月齡健康雌性家兔。

1.2 試劑與儀器 胎牛血清FBS（Sigma）；細胞培養液LDMEM；透明質酸酶（Sigma）；Ⅱ型膠原酶（Sigma）；胰蛋白酶（Sigma）；噻唑藍MTT；青霉素鈉；硫酸鏈霉素；CO2加濕培養箱（MCO15A）；倒置相差顯微鏡（Nikon）；離心機（Sigma）；生物顯微鏡（舜宇）；酶標儀（Biotek）；血細胞計數器；無菌操作臺。

1.3 方法

1.3.1 取樣與處理。耳緣靜脈注射鹽酸普魯卡因，麻醉家兔，剪掉兔耳邊緣的兔毛，用5%碘酊的消毒，酒精棉脫碘，隨后使用滅菌手術剪快速剪取1 cm×1 cm大小的兔耳組織，立即置于1 000 IU/ml的雙抗（青霉素鈉與硫酸鏈霉素）DHanks液中浸泡5 min。轉入超凈臺內操作，修剪皮膚邊緣，用含400 IU/ml的雙抗DHanks沖洗3～5遍，在200 IU/ml雙抗的DHanks液中使用無菌眼科鑷將軟骨與表皮充分剝離。

1.3.2 原代培養。處理后軟骨組織剪碎為1 mm×1 mm×1 mm的組織塊后，轉移至15 ml的離心管，加入DHanks液反復吹打，漂洗2～3次，用DMEM工作液配制的0.1%透明質酸酶在培養箱中37 ℃消化30 min，棄去透明質酸酶，加入DHanks配制的0.25%的胰蛋白酶37 ℃下消化1 h，離心棄胰蛋白酶用DHanks漂洗，加入用含5%血清的DMEM配制的Ⅱ型膠原酶，37 ℃下消化6 h，移除上清液，加入5 ml的DHanks液反復吹打，漂洗2～3次，移除上清，將組織塊均勻的分布于培養瓶底部，然后將培養瓶底部傾斜，沿斜面加入5 ml 15% 胎牛血清（FBS）100 IU/ml雙抗的DMEM培養液，底面向上倒置放入38.5 ℃、5% CO2加濕培養箱中，待組織塊貼壁后輕輕反轉培養瓶，在38.5 ℃、5% CO2加濕培養箱中繼續培養。此后，根據細胞生長狀況，每隔48～72 h換液1次，直至組織塊邊緣游離出的細胞已經完全包圍組織塊，將培養瓶內的組織塊取出，在新的滅菌培養瓶內按照相同的方法繼續培養組織塊。每日觀察并記錄軟骨細胞的形態、數目、生長、分裂和增殖等狀況。

1.3.3 細胞傳代培養。生長融合的細胞可進行傳代，用DHanks液清洗貼壁細胞3次，從培養瓶側面緩緩加入0.25%胰蛋白酶消化3～5 min，待細胞變圓變亮、將脫壁時，加入完全培養基終止消化，輕輕吹打使細胞脫落，將收集消化下的細胞置于10 ml離心管內，800 r/min離心5 min。棄上清，調整密度，以1×105個/ml接種到含15%FBS的DMEM培養液中，吸管吹打混勻，以5 ml的接種量接入培養瓶，放入培養箱中培養。24 h以后完全換液，除去未貼壁細胞，以后每72 h半量換液。

1.3.4 細胞形態觀察。在倒置顯微鏡下觀察不同代數、不同時期細胞的形態。取原代細胞爬片HE染色，顯微鏡下觀察細胞形態。

1.3.5 生長曲線的繪制。10%FBS的DMEM培養液吹打“1.2.2”中離心到的細胞，制成細胞懸浮液，用臺盼藍染色調整細胞濃度到1×105個/ml，以100 μl的接種量接入96孔培養板的孔內，同時設立不含細胞的培養基做空白對照孔，次日在每個孔內補液100 μl；24 h以后每天隨機抽取3個孔，每個孔分別加入20 μl MTT溶液，此后繼續培養4 h，再將孔內液體吸出棄掉，再加入80 μl DMSO，吹打至沉淀完全溶解后，使用酶聯免疫檢測儀于波長490 nm處測定吸光度，計算平均值。以時間為橫坐標，以平均吸光度為縱坐標，繪制細胞生長曲線。

2 結果與分析

2.1 原代培養 從圖1可以看出，處理組織塊24 h后完全貼壁，貼壁的組織塊邊緣模糊不清。貼壁后的組織塊原代培養24 h倒置顯微鏡下觀察，發現組織塊邊緣遷出少量的軟骨細胞，細胞呈梭形，細胞核不可見，細胞輪廓清晰。貼壁后培養72 h后，大量的軟骨細胞從組織塊中遷出，呈規律的放射狀排列，細胞呈梭形，細胞的透過性增強。此后細胞不斷增殖，在組織塊貼壁120 h后細胞數量達到高峰，細胞排列緊密，呈菊花瓣狀排列開，細胞核呈圓形或橢圓形，且細胞遮光性增強。

2.2 細胞爬片HE染色 從圖2可以看出，HE染色的彈性軟骨細胞形態均勻，細胞呈圓形或橢圓形，核呈橢圓形，可見雙核或多核現象。軟骨陷窩和核深染，胞漿著色均勻。細胞分裂旺盛。同族細胞群清晰可見。

2.3 生長曲線 從圖3可以看出，體外培養耳彈性軟骨細胞，原代細胞與1代細胞均在培養144 h細胞數量達到峰值。第3代細胞的延滯期長，在培養48 h開始進入對數期，培養到192 h（第8天）細胞數量達到峰值。

3 討論

原代細胞及第1代細胞的生長曲線一致，細胞生長能力旺盛。該試驗結果與溫葉飛[4]用豬耳軟骨為材料體外培養的結果相一致，而與獼猴耳軟骨細胞的生長特性有所差異，細胞倍增時間比獼猴耳軟骨細胞早24 h。兔耳第3代細胞的生長能力開始下降。潛伏期增長這一結果與豬耳軟骨細胞不同，豬耳軟骨的第6代細胞生長開始變慢。細胞體外條

件下生長受多個因素（如溫度、滲透壓、有害物質或細菌污染等）的影響。筆者在第4代細胞中發現有嚴重的霉菌污染，因此推斷第3代細胞已開始有霉菌的輕度污染，從而影響了第3代細胞的生長。

參考文獻

[1] TERADA S，FUCHS J R，YOSHIMOTO H，et al.In vitro cartilage regeneration from proliferated adult elastic chondrocytes[J].Ann Plast Surg，2005，55（2）：196-201.

[2] GORENSEK M，JAKSIMOVIC C，KREGAR-VELIKONJA N，et al.Nucleus pulposus repair with cultured autologous elastic cartilage derived chondrocytes[J].Cell Mol Biol Lett，2004，9（2）：363-373.

[3] MIZUNO M，KOBAYASHI S，TAKEBE T，et al.Reconstruction of joint hyaline cartilage by autologous progenitor cells derived from ear elastic cartilage[J].Stem Cells，2014，32（3）：816-821.

[4] 溫葉飛.耳廓軟骨細胞生物學特性研究及組織工程軟骨的體外構建初探[D].楊凌：西北農林科技大學，2004.

[5] 常慶，張秀麗，蔣欣泉.AdLacZ基因修飾山羊耳軟骨細胞復合F127構建組織工程化軟骨[J].中國組織工程研究與臨床康復，2007（32）：6326-6329.

[6] 蔣欣泉，常慶，張秀麗，等.骨形成蛋白2基因修飾的山羊耳軟骨細胞體內異位植入研究[J].中國口腔頜面外科雜志，2008（1）：38-42.

[7] 謝波，丁文峰，平亦雯，等.改良組織塊法培養原代兔耳軟骨細胞[J].塔里木大學學報，2013（2）：48-52.

[8] 冉鵬.人耳軟骨細胞體外培養的實驗研究[D].上海：復旦大學，2005.