植物病害標(biāo)本的類型及其制作技術(shù)

楊媚

摘要 論述了植物病害標(biāo)本的類型和特點(diǎn)，以及常見植物病害標(biāo)本的制作技術(shù)，旨在為農(nóng)科大學(xué)生和農(nóng)業(yè)技術(shù)人員學(xué)習(xí)相關(guān)知識(shí)提供參考素材。

關(guān)鍵詞 植物病害；標(biāo)本類型；標(biāo)本制作；教學(xué)與科研

中圖分類號(hào) S432 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）08-02359-02

Types and Manufacturing Technology of Plant Disease Specimens

YANG Mei

（College of Natural Resources and Environment， South China Agricultural University， Guangzhou， Guangdong 510642）

Abstract The types and characteristics of plant disease specimens were elaborated， as well as the making technology of common plant disease specimens， so as to provide references for the agricultural college students and agricultural technicians to learn relevant knowledge.

Key words Plant disease； Specimen type； Specimen manufacturing； Teaching and scientific research

植物病害標(biāo)本是高等農(nóng)業(yè)院校植物病理學(xué)教學(xué)和科研的重要材料，是高等農(nóng)業(yè)院校植物保護(hù)學(xué)專業(yè)多門重要骨干課程如《普通植物病理學(xué)》和《農(nóng)業(yè)植物病理學(xué)》等實(shí)驗(yàn)課環(huán)節(jié)的重要載體和教具，是理論聯(lián)系實(shí)際的重要橋梁，是加強(qiáng)實(shí)踐教學(xué)必不可缺少的實(shí)物[1]。植物病害標(biāo)本能夠形象、直觀地展示植物病害癥狀的特點(diǎn)或病原物的形態(tài)特征，并具有不受植物生長(zhǎng)季節(jié)和區(qū)域限制的特點(diǎn)，是植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)病害癥狀最好的描述。植物病害標(biāo)本的采集、制作和保存是植物病理學(xué)相關(guān)課程實(shí)驗(yàn)教學(xué)中必不可少的基礎(chǔ)知識(shí)和技能，在植物病理學(xué)的教學(xué)和科研中起著重要的作用[2]。

筆者參考近年來發(fā)表的一些文獻(xiàn)資料[1-5]，并結(jié)合自己在高等農(nóng)業(yè)院校從事植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)工作近30年的親身經(jīng)歷，對(duì)植物病害標(biāo)本的主要類型和特點(diǎn)、常見植物病害標(biāo)本的制作技術(shù)及菌種保藏技術(shù)進(jìn)行簡(jiǎn)要的介紹，以便為農(nóng)科大學(xué)生和農(nóng)業(yè)技術(shù)人員學(xué)習(xí)相關(guān)農(nóng)業(yè)知識(shí)提供參考素材。

1 植物病害標(biāo)本的主要類型和特點(diǎn)

植物病害標(biāo)本的種類多種多樣，根據(jù)取樣方法和制作方法的不同，通常分為瓶浸標(biāo)本、臘葉標(biāo)本、過塑標(biāo)本和玻片標(biāo)本等[1-5]。

1.1 瓶浸標(biāo)本

1.1.1

概念。瓶浸標(biāo)本就是將植物的罹病部位或組織（如根、莖、葉、花、果實(shí)）經(jīng)過特殊的保色處理，以保持植物原有的色澤和癥狀，之后采用防腐劑保鮮，以達(dá)到長(zhǎng)時(shí)間保存的目的。

1.1.2

特點(diǎn)。瓶浸標(biāo)本雖然能保持原色，但時(shí)間長(zhǎng)之后色澤還是會(huì)改變的，特別是肉質(zhì)水分多的植物長(zhǎng)久保存的難度較大，而且不利于大量標(biāo)本的保存。

1.2 臘葉標(biāo)本

1.2.1

概念。臘葉標(biāo)本是將植物病害標(biāo)本（如病葉）夾在吸水性強(qiáng)的紙張中，通過夾層壓制的方法，將實(shí)物標(biāo)本中的水分逐漸吸干，并放在陽光充足、通風(fēng)的環(huán)境中讓水分散失，或置于40 ℃烘箱中，使其快速干燥，便于長(zhǎng)期保存的一種標(biāo)本類型。

1.2.2

特點(diǎn)。臘葉標(biāo)本制作簡(jiǎn)單便捷，適合大量保存標(biāo)本，保存時(shí)間長(zhǎng)。但由于植物水分過高或酶的變化，在壓制過程中很難保持原有的色澤。

1.3 過塑標(biāo)本

1.3.1

概念。將病害標(biāo)本（適用于葉片和花瓣等）放在吸水紙中熨燙，在高溫下使其快速脫水而干燥，以保持原有的色澤，并用過塑膠膜將標(biāo)本封存于其中，便于觀賞和大量保存，而且攜帶方便。

1.3.2

特點(diǎn)。過塑標(biāo)本制作方便，能最真實(shí)地保持植物的原色和發(fā)病癥狀，但只適用于葉部和花瓣部病害，而且必須長(zhǎng)時(shí)間保存于冰箱中，以防變色。

1.4 玻片標(biāo)本

1.4.1

概念。玻片標(biāo)本是將植物病原物（如真菌、細(xì)菌、線蟲等）的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、顏色、大小，以及病原物如何侵入寄主，侵入寄主之后與寄主的關(guān)系等，把觀察到的現(xiàn)象，通過制片的方法封固于載玻片內(nèi)，以便永久地保存下來。

1.4.2

種類和特點(diǎn)。玻片標(biāo)本能形象、直觀地保存病原物的形態(tài)特征，是供顯微鏡觀察使用的一種標(biāo)本類型。根據(jù)制作方法的不同，可分非切片法和切片法2種（后面詳細(xì)介紹）；根據(jù)保存時(shí)間的長(zhǎng)短，可以分為臨時(shí)玻片標(biāo)本、半永久玻片標(biāo)本和永久玻片標(biāo)本3類。

1.4.2.1

臨時(shí)玻片標(biāo)本。制作簡(jiǎn)單，供暫時(shí)觀察、科研之用。保存時(shí)間為半天，浮載劑為清水。這種方法制作的標(biāo)本能最真實(shí)地反映出病原真菌孢子的大小、形態(tài)，所以最適合于孢子形態(tài)的觀察和測(cè)量，但是不能保存。

1.4.2.2

半永久玻片標(biāo)本。保存時(shí)間為3～10年。浮載劑為乳酚油、棉蘭乳酚油、沙氏液-甘油等，封藏劑為中性樹膠。用這種方法制作出的標(biāo)本，真菌孢子不變形，而且制作過程中標(biāo)本不需要脫水。

1.4.2.3

永久玻片標(biāo)本。可以永久保存，但制作過程非常復(fù)雜，封藏劑為中性樹膠或加拿大樹膠。該類玻片標(biāo)本的優(yōu)點(diǎn)是能夠連續(xù)切片，完整觀察病原真菌的發(fā)育過程。過去，人們通常采用石蠟包埋切片，標(biāo)本需要用梯度的有機(jī)溶劑把植物組織中的水分置換出來，進(jìn)行徹底脫水，主要步驟包括浸蠟、包埋、切片、貼片、去蠟、透明、染色等一系列的過程，步驟非常繁瑣。現(xiàn)在，人們已采用冰凍切片法代替石蠟包埋切片法，效率大大提高，但需要購買昂貴

的冰凍切片機(jī)。

2 常見植物病害標(biāo)本的制作技術(shù)

2.1 瓶浸標(biāo)本

適用于病葉片、腐爛的水果、粗大的塊根和塊莖，以及肉質(zhì)子囊菌和擔(dān)子菌的子實(shí)體等。

2.1.1

保存綠色的浸漬液制作技術(shù)。原理：用藥劑中的銅離子把葉綠素中的鎂離子置換出來，使葉片的綠色能穩(wěn)定長(zhǎng)久的保持。使用的藥劑有醋酸銅和硫酸銅。

方法一：將醋酸銅完全溶解于50%的醋酸溶液中，作為母液。根據(jù)植物標(biāo)本顏色的深淺稀釋使用。標(biāo)本需放在加熱沸騰的溶液中處理，綠色開始褪去，之后綠色逐漸恢復(fù)。

方法二：將標(biāo)本置于硫酸銅溶液中浸泡6～24 h，取出即可。時(shí)間長(zhǎng)短可根據(jù)葉片和其他器官的厚薄程度而定。

2.1.2

保存黃色和橘黃色的浸漬液制作技術(shù)。葉黃素和胡蘿卜素在細(xì)胞的色素中，不溶于水。可直接用5%～6%的亞硫酸配成4%～10%的水溶液進(jìn)行保存。亞硫酸有漂白的作用，所以濃度不宜過高。

2.1.3

保存紅色的浸漬液制作技術(shù)。紅色大多為花青素，溶于水，所以很難保存。一般采用瓦查浸漬液和赫斯婁浸漬液浸泡2周后保存。

2.1.4

防腐浸漬液制作技術(shù)。將經(jīng)過保色處理的標(biāo)本，保存于5%的福爾馬林和5%～6%的亞硫酸溶液中，可用玻璃瓶或有機(jī)玻璃瓶[2]，再用石蠟密封瓶口，以防止藥劑揮發(fā)或氧化。

2.2 臘葉標(biāo)本

臘葉標(biāo)本的制作方法簡(jiǎn)單而經(jīng)濟(jì)，標(biāo)本可以長(zhǎng)時(shí)間保存，所以應(yīng)用最廣。制作方法主要有兩種。

方法一：葉或莖可以壓制于吸水性強(qiáng)的標(biāo)本紙中，用標(biāo)本夾夾緊，日曬或置于40 ℃的烘箱中，夏季溫度高、濕度大，標(biāo)本容易發(fā)霉，要勤換標(biāo)本紙，直至標(biāo)本完全干燥為止。

方法二：標(biāo)本干燥越快，越能保持原有色澤。可將標(biāo)本置于冰箱中，任其快速干燥。

2.3 過塑標(biāo)本

過塑標(biāo)本的制作方法快速、簡(jiǎn)單、便捷，保持綠色最為真實(shí)、直觀。將葉片夾在吸水紙中熨燙，高溫下熨斗不停地在標(biāo)本上來回熨燙，使葉片均勻受熱，并能快速脫水而干燥，直至葉片變脆為止。再用過塑膠膜將標(biāo)本封固其中，置于冰箱保存即可。

2.4 玻片標(biāo)本

根據(jù)制作方法的不同，玻片標(biāo)本可分非切片法和切片法2種。

2.4.1

非切片法。

就是不用經(jīng)徒手切片或機(jī)械切片的方法而制成的玻片標(biāo)本。操作簡(jiǎn)便而快，組織各部分均不被切斷，能保持病原菌原有狀態(tài)，一般適用于自身很小而又扁平的材料。

2.4.1.1

挑刮法。在基物表面生長(zhǎng)茂密的霉?fàn)钗铮缢共　追鄄〉龋捎眉饧?xì)的解剖針挑取或刀片刮取霉層，放在浮載劑中制片。

2.4.1.2

撕表皮法。對(duì)一些表生菌如霜霉菌、白粉菌（無性態(tài)）等，為了觀察病原菌在寄主表面生長(zhǎng)的自然狀態(tài)或與寄主表面之間的聯(lián)系，可將寄主的表皮連同病原菌一起撕下來，放在浮載劑中制片。

2.4.1.3

粘貼法。有些病原菌是附生于葉片表面上的，用其他方法會(huì)破壞病原菌生長(zhǎng)的完整性，所以采用易揮發(fā)的火棉膠把病原菌粘貼出來，置于載玻片上，再用丙銅溶去火棉膠，將剩下的完整的病原菌制成玻片。如柑橘小煤炱、鏈格孢或其他霉?fàn)钗铩?duì)于臨時(shí)觀察的玻片，也可用透明膠帶代替火棉膠。

2.4.1.4

玻片培養(yǎng)菌法。將蓋玻片斜插于接菌的培養(yǎng)基上，病原菌就會(huì)沿著蓋玻片向上生長(zhǎng)，取出長(zhǎng)滿菌絲體的蓋玻片放在浮載劑中制片。此法適用于氣生菌絲旺盛的病原菌，如絲核菌、白絹菌、青霉菌、根霉菌等。

將病原菌孢子置于載玻片水滴中萌發(fā)，然后加入浮載劑制片。此法適用于各種病菌的孢子萌發(fā)，如黑粉菌、銹菌的擔(dān)子和擔(dān)孢子制片。

2.4.1.5

涂抹法。適用于酵母菌、細(xì)菌、黑粉菌的制片。將病原菌配成孢子懸浮液，均勻地涂抹于玻片上制片。

2.4.1.6

病組織整體透明法。此法適用于觀察病原菌侵入寄主的整個(gè)過程或在寄主上的病原菌結(jié)構(gòu)如卵孢子。可切取一小塊寄主組織置于乳酚油中加熱沸騰，寄主會(huì)逐漸透明起來，或者用KOH水溶或水氯乙醛進(jìn)行透明，從而觀察寄主組織中的病原菌。

2.4.2

切片法。切片法適用于觀察發(fā)病組織的病變、病原菌侵入寄主的方式和在寄主內(nèi)擴(kuò)展的情況，以及子實(shí)體的內(nèi)外結(jié)構(gòu)等。通過將病害材料切成薄片，從而能完整地觀察到病原菌與寄主間的各種關(guān)系。

2.4.2.1

徒手切片法。徒手切片法簡(jiǎn)單，不需特殊設(shè)備，在短時(shí)間內(nèi)可以切取許多薄片，所以是應(yīng)用最廣泛的一種方法。徒手切片法是指用刀片直接將病害材料切成薄片，盡管所切得的薄片不夠均勻，但此法至今仍是植病工作者必須熟練掌握的一門技術(shù)。一般制成半永久玻片標(biāo)本。

2.4.2.2

石蠟切片法。石蠟切片法是將新鮮材料經(jīng)過各種藥劑脫水處理后，用石蠟進(jìn)行包埋，置于石蠟切片機(jī)上，連同石蠟一起進(jìn)行切片，再將薄片（蠟帶）粘貼在載玻片上，然后脫蠟、染色，制成永久的玻片標(biāo)本。石蠟切片法是植物病理學(xué)和真菌學(xué)制片技術(shù)中最經(jīng)典的制片方法之一。但石蠟切片法過程復(fù)雜，步驟繁瑣，所需藥品多，用具多，耗時(shí)長(zhǎng)，需要經(jīng)過固定、脫水、透明、滲蠟、包埋、切片、貼片、展片、脫蠟、染色、封片等一系列復(fù)雜的過程。

2.4.2.3

冰凍切片法。冰凍切片法是將材料直接放在冰凍切片機(jī)上進(jìn)行切片的一種方法，是目前最先進(jìn)的一種制片技術(shù)。冰凍切片常用于病原菌分類、病害鑒定、病理組織切片與細(xì)胞化學(xué)的制片。在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)上，冰凍切片應(yīng)用很廣泛。冰凍切片法的優(yōu)點(diǎn)是快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、不需要任何試劑，可以在精確的控制精密度下連續(xù)切片，但條件是必須要有昂貴的冰凍切片機(jī)。

3 小結(jié)

由于植物病害標(biāo)本能夠形象、直觀地展示植物病害癥狀的特點(diǎn)或病原物的形態(tài)特征，并具有不受植物生長(zhǎng)季節(jié)和區(qū)域限制的特點(diǎn)。因此，植物病害標(biāo)本在植物病理學(xué)的教學(xué)和科研中起著重要的作用。需要指出的是，盡管植物病害標(biāo)本多種多樣，制作方法也各不相同，但對(duì)于同一植物病害部位的標(biāo)本，有時(shí)可采用多種不同的病害標(biāo)本制作技術(shù)，使得標(biāo)本具有多樣化。

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