微波萃取液相色譜—電感耦合等離子體質譜聯用測定水產品中甲基汞、乙基汞和無機汞

王賢波　 劉軍波　 余霞奎等

摘要 [目的]研究水產品中甲基汞、乙基汞和無機汞的檢測方法。[方法]采用Hypersil gold 150×4.6 mm色譜柱進行HPLC分離條件優化，用含Li、Co、In、U各1 μg/L的調諧液進行ICPMS參數優化，對樣品進行微波萃取。[結果]采用鹽酸微波萃取樣品，C18柱（150×4.6 mm）分離，流動相為5%甲醇-0.06 mol/L乙酸銨-1 g/L半胱氨酸。甲基汞、乙基汞的線性范圍均為0.5～100.0 μg/L，檢出限分別為0.2、0.3 μg/L；無機汞線性范圍均為0.5～20.0 μg/L，檢出限為0.2 μg/L。不同濃度下甲基汞、乙基汞、無機汞的加標回收率分別為89%～98%、82%～89%、86%～96%。魚肉標準物質（GBW10029）中汞形態的測定均值在標準值范圍內。 [結論]該方法前處理簡便、精密度高、準確性好，適用于水產品中汞化合物的形態分析。

關鍵詞 微波萃取；液相色譜-電感耦合等離子體質譜；甲基汞；乙基汞；無機汞

中圖分類號 S181.3 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2014）08-02438-03

Simultaneous Determination of the Content of Methyl Mercury，Ethyl Mercury and Inorganic Mercury in Microwave Extraction of Aquatic Products by HPLCICPMS

WANG Xianbo et al （Laboratorial Center， Hangzhou Institute of Agricultural Sciences， Hangzhou， Zhejiang 310024）

Abstract [Objective] To observe the detection method of methyl mercury（MMC）， ethyl mercury（EMC） and inorganic mercury（MC） in aquatic products. [Method] Using Hypersil gold 150 × 4.6 mm chromatographic column for optimization of HPLC separation conditions， The ICPMS parameter optimization using tuned liquid containing Li， Co， In， U 1 μg/L， The samples were extracted by microwave. [Result] The sample was extracted with hydrochloric acid and separated on a C18 chromatographic column（150 × 4.6 mm） using 5% methanol0.06 mol/L ammonium acetate1 g/L cysteine as mobile phase. The linear ranges for methyl mercury and ethyl mercury were all between 0 and 100 μg/L with the detection limits 0.2 μg/L and 0.3 μg/L. The linear ranges for inorganic mercury was 0 and 20 μg/L with the detection limits 0.2 μg/L. The spiked recoveries for different concentrations of mercury compounds were in the range of 89%98% for MMC， 82%-89% for EMC and 86%96% for MC. The method was applied in the determination of mercury speciations in fish reference material（GBW 10029） and the analytical result was in the scope of standard value. [Conclusion] The results indicated that the method had a simple pretreatment procedure， good accuracy and precision， and was suitable for the determination of mercury speciations in aquatic products.

Key words Microwave extraction； HPLCICPMS； Methyl mercury； Ethyl mercury； Inorganic mercury

汞是對人類和高等生物最具危害的元素之一，有機汞化合物在農業中常用作殺蟲劑和殺菌劑，無機汞通過生物甲基化作用生成毒性更強的甲基汞，從而被動植物吸收，并通過食物鏈的富集作用進入人體，其富集倍數可高達106～107[1]。汞化合物的毒性依賴于其濃度及化學形態，烷基汞的毒性比芳基汞和無機汞大，甲基汞是毒性最強的汞化合物之一[2]。鑒于不同形態汞化合物的毒性差異，采用高靈敏度的形態分析方法測定環境樣品和生物樣品中汞的含量非常必要[3]。

目前測定汞形態的方法很多。最早的方法標準為氣相色譜法[4]，但該方法存在前處理繁瑣，需要對樣品進行多步萃取和凈化以減少基體干擾，巰基棉回收率不穩定，進樣過程中需要定期往色譜柱內注入二氯化汞苯飽和溶液對色譜柱進行“鈍化”， 以保證峰的重現性等問題。液相色譜[5] 、氣相色譜與光譜技術聯用也被用于分析汞化合物[6-9]。高效液相色譜以其前處理簡單、適用性強，可與原子吸收（AAS） 、原子熒光（AFS）、電感耦合等離子質譜（ICPMS）、電感耦合等離子光譜（ICPAES）等多種技術聯用而廣泛應用于汞形態分析[10-11]。筆者采用鹽酸微波提取水產品中的汞，以半胱氨酸取代劇毒管制試劑巰基乙醇為絡合劑，采用微波萃取液相色譜-電感耦合等離子體質譜（HPLC ICPMS）聯用技術對其中的甲基汞、乙基汞、無機汞的含量進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑。包括色譜柱（Thermo Hypersil gold 150×4.6 mm）、鹽酸、氨水（優級純）、甲醇（色譜純）、半胱氨酸（生化試劑）、乙酸銨（分析純）、汞標準溶液為甲基汞（MMC）GSB 0715032002，濃度為10 mg/L；乙基汞（EMC）GSB 0715042002，濃度為10 mg/L；無機汞（MC）GSB0712742000，濃度為100 mg/L，魚肉標準物質GBW10029，均購于國家標準物質中心。

1.1.2 主要儀器。包括電感耦合等離子體質譜（Thermo X Series 2）、高效液相色譜（戴安 UltiMate3000）、微波萃取儀（CEM Explorer）、離心機3-30K（德國 Sigma）、純水儀（Millipore MilliQ）、電子天平（METTLER公司）。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液配制。分別取一定量甲基汞、乙基汞、無機汞，用超純水稀釋定容，配成1 mg/L的混合標準溶液，所配溶液均儲存于4 ℃的冰箱中。汞標準工作液由1 mg/L混合標準溶液用流動相與2%鹽酸按1∶1逐級稀釋而成， 使用時現配。

1.2.2 ICPMS參數優化。配制含Li、Co、In、U各1 μg/L的調諧液，運行儀器，將溶液進樣管插入到調諧液中，并調節炬箱水平（minorhorizontal）、垂直位置（minorvertical）以及霧化器流速（majornebuliser）等幾個參數設置，通過觀察Li、Co、In、U四元素的信號強度的大小，使儀器靈敏度達到最佳。

1.2.3 HPLC分離條件優化。分別配制含0.06 mol/L乙酸銨、1 g/L半胱氨酸的5%甲醇水溶液，含0.06 mol/L乙酸銨、1g/L 2-巰基乙醇的5%甲醇水溶液作為流動相。采用熱電公司Hypersil gold 150×4.6 mm色譜柱，柱溫30 ℃，流速1 ml/min。用超純水配制含有甲基汞、乙基汞、無機汞的混合溶液，濃度均為1 μg/L，進樣量100 μl，等流速洗脫。

1.2.4 微波萃取條件。取0.50 g樣品，加入10 ml 5 mol/L鹽酸，在80 ℃、微波功率800 W條件下微波萃取10 min。8 000 rpm離心10 min，收集上清液，用氨水調節pH至7左右，用去離子水稀釋定容至25 ml，0.45 μm濾膜過濾后上機測定。

2 結果與分析

2.1 電感耦合等離子質譜（ICPMS）參數 通過調節儀器的各項參數，得到ICPMS儀器工作條件分別為射頻功率1 400 W、排廢液泵速30 rpm、霧化器旋流霧室、霧化器流量0.92 L/min、冷卻氣流量13.0 L/min、輔助氣流量0.80 L/min、采樣深度150步、模擬電壓1 800 V、脈沖電壓2 920 V、駐留時間0.4 s。為了消除錐口的碳沉積，需要降低霧室的溫度，同時流動相中含有大量的水，為防止霧化室結冰又不宜使用過低的溫度，所以該試驗中使用2 ℃，該溫度既可以減少進入ICPMS的有機試劑總量，又不會導致霧化室結冰。

2.2 HPLC分離條件 當采用5%甲醇、0.06 mol/L乙酸銨、1 g/L 2巰基乙醇為流動相時，3種汞化合物能完全分離（圖1a），但分離時間長，需要32 min，且2巰基乙醇屬劇毒管制試劑，氣味難聞；當采用5%甲醇、0.06 mol/L乙酸銨、1 g/L半胱氨酸為流動相時，3種汞化合物在8 min內能完全分離（圖1b），且半胱氨酸無毒無害，故此試驗選用半胱氨酸為絡合劑。

圖1 以2-巰基乙醇（a）和半胱氨酸（b）為絡合劑的3種汞形態分離質譜圖

2.3 線性范圍、檢出限試驗 配制一系列3種汞化合物的混合標準溶液，質量濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、100.0 μg/L，在優化試驗條件下進行線性范圍試驗，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。以3倍基線噪聲測定3種汞形態的檢出限（S/N=3），結果（表1）發現，甲基汞、乙基汞在0.5～100.0 μg/L范圍內有良好的線性，檢出限分別為0.2、0.3 μg/L；無機汞在0.5～20.0 μg/L范圍內有良好的線性，檢出限為0.2 μg/L，無機汞在100.0 μg/L時測定值偏低，這可能與無機汞不太穩定有關。

2.4 精密度試驗 配制質量濃度為10 μg/L甲基汞、乙基汞、無機汞3種汞化合物混合溶液，在同一日內多次重復進樣，利用標準曲線計算測得的濃度，以測得的濃度計算相對標準偏差（RSD）。由表2可見，甲基汞、乙基汞、無機汞在同一日內具有良好的穩定性，其RSD均小于5%。由于天然水產品中很難找到3種汞化合物均存在的樣品，因此模擬制備3個濃度的樣品，平行測定其汞化合物含量，計算相對標準偏差（RSD）（表3）發現，模擬樣品低、中、高3個濃度均具有良好的精密度，RSD均小于5%。

2.5 加標回收率 分別向鯽魚樣品中加入3種不同濃度汞化合物，測定3種汞化合物的加標回收率，由表4可見，不同加標濃度的回收率分別為甲基汞89%～98%、乙基汞82%～89%、無機汞86%～96%。

2.6 標準物質測定 用HPLCICPMS對魚肉標準物質（GBW10029）進行汞化合物測定。由圖2可知，魚肉標準物質中主要為甲基汞，魚肉標準物質測定均值為838.3 μg/kg，參考值為840±30 μg/kg，可見試驗結果在標準范圍內。

3 結論與討論

采用HPLCICPMS測定水產品中的甲基汞、乙基汞和無機汞，對試驗條件進行了優化，用半胱氨酸取代劇毒管制試劑巰基乙醇且分析時間縮短。汞化合物各形態的相對標準偏差（RSD）均小于5%，該方法前處理簡單、精密度高、準確性好，適用于水產品中汞形態的測定。

用PEEK管連接色譜柱和霧化室，由于使用C18反相柱時，色譜流動相中需加入有機溶劑，但高有機負載可能導致ICPMS分析信號的不穩定，尤其是甲醇分解所產生的碳粉可能導致ICPMS錐口的堵塞，所以選用含碳量較少的甲醇，而不使用乙腈，且甲醇使用濃度僅為5%（V/V）。另外，在流動相中加入少量乙酸銨以改善峰形，加入1 g/L半胱氨酸以確保Hg的洗脫效率，同時可以較好地消除離子型Hg的記憶效應[12]。3種形態的汞在反相色譜中出峰順序依次為甲基汞、乙基汞、無機汞。

參考文獻

[1]

呂超，劉麗萍，董慧茹，等.鹽酸提取-液相色譜-原子熒光聯用技術檢測水產品中甲基汞等汞化合物[J].分析試驗室，2010，29（2）：64-68.

[2] 商立海， 馮新斌，閻海魚，等.環境樣品中甲基汞的分析方法綜述[J].地球與環境， 2004， 32（1）： 17-22.

[3] 鄧小紅.環境中汞的形態分析[J].渝西學院學報，2003，2（3）： 42-45.

[4] 朱霞萍，張勇，汪模輝，等.毛細管氣相色譜法測定生物樣品中痕量甲基汞[J].理化檢驗： 化學分冊， 2006， 42（5）：344-346.

[5] 盧瑞宏.高效液相色譜有機汞形態分析[J].廣東化工， 2006， 33（3）：41-42.

[6] 梁淑軒， 龐秀言，孫漢文.超短柱氣相色譜與原子吸收聯用技術的優化及其在甲基汞形態分析中的應用[J].中國衛生檢驗雜志， 2002， 12（3）：262-263.

[7] 史建波，廖春陽，王亞偉，等.氣相色譜和原子熒光聯用測定生物和沉積物樣品中甲基[J].光譜學與光譜分析，2006，26（2）：336-339.

[8] 朱霞萍，汪模輝，倪師軍，等.固相微萃取-原子熒光測定魚樣品中痕量甲基汞[J].分析試驗室， 2006，25（9）：49-52.

[9] 閻海魚，馮新斌， LIANG L，等. GCCVAFS法測定魚體內甲基汞的分析方法研究[J].分析測試學報， 2005，24（6）：78-80.

[10] 墨淑敏，梁立娜，蔡亞歧，等.高效液相色譜與原子熒光光譜聯用分析汞化合物形態的研究[J].分析化學， 2006，34（4）：493-496.

[11] YU L P.Cloud point extract on preconcentration prior to high-performance liquid chrom atography coupled with cold vapor generation atomic fluorescence spectrometry for speciation analysis of mercury in fish samples[J].J Agric Food Chem， 2005， 53（25）：9656-9662.

[12] 王征，游飛明，邱秀玉，等.HPLCICPMS法測定水樣中的甲基汞、乙基汞和無機汞[J].福建分析測試， 2009，18（1）：28-31.