紫花苜蓿玀sCOL1基因植物表達載體的構建及擬南芥轉化

蘇志芳等

摘要[目的]構建紫花苜蓿MsCOL1基因植物的表達載體。[方法]根據紫花苜蓿CONSTANS類似基因MsCOL1基因（登錄號：DQ661682）序列，設計含有酶切位點的一對特異性引物，以紫花苜蓿cDNA為模板，獲得MsCOL1基因完整編碼區DNA序列，并將目的片段插入表達載體pBI121的相應位置，構建植物表達載體35S∷MsCOL1，再利用農桿菌介導方法將35S∷MsCOL1轉化到擬南芥中。[結果]分析測序結果顯示，所獲得克隆為插入目的片段的陽性克隆。經RTPCR 檢測，證明轉基因植株中MsCOL1基因能夠順利表達。[結論]該方法成功構建植物表達載體35S∷MsCOL1，并獲得了轉基因擬南芥植株。

關鍵詞紫花苜蓿；擬南芥；轉基因；MsCOL1

中圖分類號S541+.1文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）06-01610-02

Abstract[Objective] To construct plant expression vector of MsCOL1 gene from alfalfa. [Method] Based on the sequence of alfalfa CONSTANSLike 1 （MsCOL1） gene （Access No.： DQ661682）， two pairs of specific primers containing different enzyme sites were designed. With the template of fulllength cDNA， the coding domain sequence of MsCOL1 was obtained， which was inserted into the restrict sites of expression vector pBI121， resulting plant expression vector 35S：：MsCOL1. Mediated by Agrobacterium tumefaciens， 35S：：MsCOL1 was transformed into Arabidopsis thaliana. [Result] PCR testing showed that 15 transgenic plants were obtained. [Conclusion] These results indicated that the plant expression vector 35S：：MsCOL1 was constructed and transgenic Arabidopsis plants with MsCOL1 gene were obtained successfully.

Key wordsAlfalfa； Arabidopsis thaliana； Transgene； MsCOL1

有關植物開花時間的分子生物學研究，在模式植物擬南芥上已經進行得相對全面、深入。在調控擬南芥開花時間的光周期途徑中，CONSTANS（CO）基因的表達控制擬南芥感知日照時間的長短，在連接光信號與生物信號過程中起關鍵性作用，該基因編碼一個含有鋅指結構的核蛋白[1]。當植物受到長時間光照時，CO基因的mRNA表達量增加[2]。CO基因是FT基因[1]和SOC1基因[3]的上游基因，其轉錄因子能促進植物開花。在擬南芥開花時間有關基因調控研究中，CO基因突變體能使開花時間延遲，通過調節增加CO基因的表達，可以使FT基因的表達量提高，使植物開花行為提前發生[1]。但是在CO基因的同源基因COL的表達模式中，功能有所差異。過表達COL1基因只能使其晝夜節律明顯縮短，但對植物開花時間沒有產生干擾；COL2基因的表達量對植物開花時間沒有干擾[4]；COL3基因的表產物對紅色波長信號敏感，并且能使根部細胞生長加快[6]。COL9基因的超量表達能使植物延遲開花[5]。相關研究結果表明，通過轉基因方法將擬南芥CO基因導入馬鈴薯中進行過表達，使馬鈴薯的帶花現象延遲[7]。此外，水稻中的一個CO的同源基因OsCO3在水稻中過表達時能導致水稻開花推遲[8]。

在植物生長發育中，開花時間是一個非常重要的生理事件。開花時間受到多種基因調控。已克隆的與開花時間相關基因僅在擬南芥、水稻等少數幾種植物中成功獲得。通過對這些基因進行分析，種間的CO基因存在較高的保守性，但其在作用機理上卻存在較大差異。此外，由于CO基因在植物中屬于一個包含多拷貝的基因家族，這個家族中其他拷貝的基因是否與調控開花時間有關還不是很清楚，故仍需深入研究。為了揭示植物開花時間的調控基因網絡，需要對開花時間相關基因的作用機理及互作模式進行深入研究。

轉基因技術是通過構建使目標基因過量表達的DNA載體，將其轉化到植物體內實現基因功能。筆者將構建的紫花苜蓿MsCOL1基因過量表達載體，應用農桿菌轉化法獲得擬南芥轉基因植株，以期為研究該基因的功能奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株與質粒。大腸桿菌菌株為E.coli DH5α，購自上海申能博彩生物科技有限公司；克隆載體 pMD19T與植物表達載體pBI121，由內蒙古巴彥淖爾市農科院畜牧所惠贈；農桿菌菌株GV3101，實驗室保存。

1.1.2主要試劑。限制性內切酶、T4DNA連接酶及DNA回收試劑盒，均購自TaKaRa公司；DL2000 DNA Marker和 Tap DNA聚合酶，購自北京天根生物科技有限公司；其他試劑均為國產分析純，市售。

1.2.3MsCOL1基因表達載體構建及鑒定。利用質粒小提試劑盒，對含有正確MsCOL1基因序列的大腸桿菌，提取質粒，使用XbaI和BamHI雙酶切，經凝膠電泳檢測分別回收目的片段后，使用T4連接酶16 ℃連接6 h后，轉化感受態大腸桿菌DH 5α，在含有50 mg/L卡納霉素的LB固體培養基上劃線培養，挑取單克隆菌落，進行PCR鑒定，以CO1f和CO1r為引物；然后將含有目的條帶的菌液送至北京三博遠志測序鑒定。構建的植物表達載體命名為35S∷MsCOL1。

1.2.4農桿菌介導法轉化擬南芥及其鑒定。提取35S∷MsCOL1質粒并純化，用CaCl2凍融法將重組子導入農桿菌GV3101中，菌液PCR篩選陽性克隆。利用花序浸泡法，對處于花蕾期的野生型擬南芥進行農桿菌介導的轉化，具體步驟為：將已經長出腋生花序的擬南芥植株在含有pBINCED4的農桿菌菌液浸泡約5 min，罩上塑料袋，在恒溫箱中放置，暗培養24 h，一周后再次浸入農桿菌懸浮液浸染，溫室中待擬南芥生長成熟。收集擬南芥種子，在無菌條件下，將擬南芥種子用70%酒精浸泡10 min后，用蒸餾水清洗，然后均勻撒在含有50 mg/L卡那霉素1/2Ms培養基上。15 d后，選取正常生長的擬南芥幼苗，轉移到土中，繼續生長。

1.2.5再生植株檢測。采用CTAB法提取抗性苗基因組DNA，以CO1f和CO1r為引物，以基因組DNA為模板進行PCR檢測。

2結果與分析

2.1紫花苜蓿MsCOL1基因植物表達載體構建及鑒定以紫花苜蓿第一鏈cDNA為模板，以引物CO1f和CO1r進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，得到的片段大小與預期結果一致（圖1）。PCR產物分別用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收后，與克隆載體pMD19T載體連接。轉化后，挑取陽性克隆鑒定并測序。分析測序結果顯示，所獲得克隆為插入目的片段的陽性克隆。

具有發夾結構的RNAi載體pARTSA使紫花苜蓿的MsCOL1基因表達量有所下降[9]。張威威等構建了銀杏pCAMBIA1304GbCOab表達載體，用轉基因來研究CO基因功能是一種常用的方法，該方法已經在很多實驗中得到應用[10]。

試驗為了構建MsCOL1基因超表達載體，通過PCR擴增的方式在目的基因開放閱讀框兩端分別引入XbaⅠ和BamHⅠ酶切位點，保證了連接方向的準確性。將分離到的基因構建表達載體轉入擬南芥中進行過量表達，得到成功轉化的轉基因苗，進一步研究了MsCOL1基因及NCED4基因的功能。試驗采用農桿菌介導的方法轉化擬南芥，并通過PCR反應與未轉化的植株對比驗證，結果顯示所轉化的4株全部為陽

性，證實目的基因已轉入擬南芥基因組中。研究將構建的MsCOL1基因過量表達載體導入擬南芥中，得到轉基因植株，對該基因功能的研究具有重要的價值。

參考文獻

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