陶氏化學(xué)格利特消毒劑GLUTEX GS2對犬細(xì)小病毒殺滅效果的測試

李亞雄　仇正興

摘 要：本研究參照美國國家環(huán)境保護(hù)局（EPA）關(guān)于消毒劑在干燥的非生物表面的抗病毒效果測評方法，評定了美國陶氏化學(xué)公司的格利特消毒劑GLUTEX GS2對犬細(xì)小病毒的殺毒效力。結(jié)果表明：經(jīng)合成硬水1：256倍稀釋的格利特消毒劑GLUTEX GS2，在與干燥處理的犬細(xì)小病毒膜充分接觸10 min后，病毒活性低于2.5個滴度，表明此消毒劑對犬細(xì)小病毒具有殺滅效力，可用于此病毒的日常消毒中。

關(guān)鍵詞：犬細(xì)小病毒；抗病毒效果；評測；GLUTEX GS2消毒劑

1 實驗?zāi)康?/p>

本測試旨在測評陶氏化學(xué)公司生產(chǎn)的格利特消毒劑GLUTEX GS2的殺病毒效力。其方法是，該產(chǎn)品先按要求進(jìn)行稀釋，隨后用稀釋液處理受病毒污染的物體表面，然后從處理物體表面回收病毒，通過評估回收病毒的傳染力確定消毒劑的消毒效率。

2 實驗材料和方法

2.1 測試病毒

試驗所用犬細(xì)小病毒（CPV MLV）由美國康奈爾大學(xué)M. J. Appel博士提供。該病毒懸浮液是組織培養(yǎng)基。

2.2 細(xì)胞組織培養(yǎng)液和培養(yǎng)基

本研究所用犬腫瘤細(xì)胞來自位于美國馬里蘭州羅克維爾的美國標(biāo)準(zhǔn)菌庫（American Type Culture Collection，ATCC）。細(xì)胞培養(yǎng)物在添加了10 %（V/V）牛胎兒血清（在56 ℃ 熱滅活30 min）、100 單位/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、50 μg/mL慶大霉素、 2.5 μg/mL兩性毒素B和25 mM四羥乙基哌嗪乙磺酸的最低必需培養(yǎng)基（Minimal Essential Medium，MEM）中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)后置于37 ℃含5 %CO2的潮濕空氣下的一次性實驗室器皿中，制成單層組織培養(yǎng)物。感染病毒后，培養(yǎng)物置于裝有相同成分并添加了50 ng/mL（Calbiochem）表皮生長因子。

2.3 試劑

磷酸鹽緩沖液（PBS緩沖液）采用Dulbecco和Vogt的方法配制（實驗醫(yī)學(xué)雜志[J]. 1954， Vol.99：167-182）。合成硬水在使用當(dāng)天配制，配制方法參照 AOAC 4.024法{美國[美國公職分析化學(xué)工作者協(xié)會（AOAC）]，第14版，1984，第70～71頁}。

2.4 消毒劑的制備

每份消毒劑在使用當(dāng)天按照1∶256的比例用1 247 mg/kg AOAC合成硬水進(jìn)行稀釋。

2.5 病毒膜的制備

病毒膜通過將0.2 mL的病毒懸浮液涂復(fù)在滅菌的皮氏玻璃培養(yǎng)皿底部制作而成。隨后置于室溫（約23 ℃）及環(huán)境濕度下，避免直接光照直至明顯干燥（約45～75 min）。

2.6 用消毒劑處理病毒薄膜

干燥的病毒薄膜在約23 ℃下用2.0 mL消毒劑稀釋液（噴霧）處理，使兩者保持10 min的充分接觸。在接觸一定時間后，用橡膠淀帚刮下培養(yǎng)皿底部物質(zhì)，并立即取一小份病毒-消毒劑混合物加入交聯(lián)葡聚糖（Sephadex）凝膠過濾柱中，用凝膠過濾法將病毒從消毒劑中分離出。

2.7 病毒對照薄膜的處理

在用消毒劑處理一份病毒薄膜時，另一份相同病毒薄膜用2 mL磷酸鹽緩沖生理鹽水再次懸浮，隨后取一小份混合液加入交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex）過濾柱中。

2.8 交聯(lián)葡聚糖凝膠過濾（Sephadex Gel Filtration）

交聯(lián)葡聚糖凝膠過濾按照Blackwell和Chen的改良方法[美國公職分析化學(xué)工作者協(xié)會雜志53期（1970年）第1229～1236頁]進(jìn)行操作。3 cc交聯(lián)葡聚糖柱（LH-60-120）利用磷酸鹽緩沖生理鹽水保持平衡，離心清除液體中的空隙體積，隨后裝入約0.6 mL病毒-消毒劑混合液或病毒-磷酸鹽緩沖對照混合液，并再次離心。

2.9 病毒回收分析

對每份病毒-消毒劑和對照病毒濾出液進(jìn)行稀釋，接種至細(xì)胞培養(yǎng)液中。每份稀釋液至少使用4份培養(yǎng)液。接種0.05 mL單層細(xì)胞，并在37 ℃下培養(yǎng)1 h。干燥后，加入維持培養(yǎng)基（0.2 mL），并在恒溫37 ℃下接種培養(yǎng)液。接種7 d后，記錄培養(yǎng)液細(xì)胞病變效應(yīng)。細(xì)胞病變效應(yīng)最終結(jié)果見表1。

2.10細(xì)胞毒性對照

每份已稀釋消毒劑通過交聯(lián)葡聚糖凝膠過濾，利用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行倍比稀釋，隨后接種于添加病毒消毒劑混合液的細(xì)胞培養(yǎng)液中。接種后7 d后，記錄細(xì)胞培養(yǎng)液的細(xì)胞毒性。

2.11 計算方法

采用Reed-Muench法（L. J. Reed和H. Muench. 美國衛(wèi)生醫(yī)學(xué)雜志[J].1938，Vol.27：493-497），計算以50 %侵染性的log10（TCID50）和毒性（TD50），以表示病毒效價及細(xì)胞毒性。

3 實驗結(jié)果

格利特消毒劑GLUTEX GS2對犬細(xì)小病毒的病毒感染性和細(xì)胞毒性測定結(jié)果見表1。

4 實驗結(jié)論

陶氏化學(xué)公司格利特消毒劑GLUTEX GS2在測試條件下，能有效殺滅犬細(xì)小病毒。□□