日糧核苷酸對減少由T—2毒素和嘔吐毒素誘導的雞白細胞DNA損傷的作用

賀淼

摘 要：本研究旨在通過測定T-2毒素和嘔吐毒素（Deoxynivalenol，DON）對脾臟白細胞DNA片段化和雞氧化應激的影響，以評估日糧核苷酸對毒素誘導的DNA損傷的修復潛力。選用雄性肉雞，分別飼喂添加或不加核苷酸的含有10 mg/kg的T-2毒素或嘔吐毒素的飼糧。試驗進行17 d后，利用“彗星”分析法（又叫單細胞凝膠電泳）檢測脾臟白細胞的DNA損傷，通過測定血漿和肝臟中的丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量及血漿中的總抗氧化水平（Total Antioxidant Status，TAS）和谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GPx）含量來評判機體的脂質過氧化程度，肝毒性通過血漿中肝酶（谷丙轉氨酶ALT，谷草轉氨酶AST和谷氨酰轉肽酶GGT）水平來評定。T-2毒素和嘔吐毒素能誘導的雞脾臟白細胞DNA的片段化，補充核苷酸只能減少T-2毒素引起損傷的程度。相比于空白對照組，飼糧中含有T-2毒素的添加或不添加核苷酸的兩個處理組肉雞的TAS和AST顯著減小。飼糧中含有T-2毒素和嘔吐毒素的處理組肉雞血漿和肝臟組織中的MDA含量與對照組相比沒有顯著性差異。當肉雞飼喂含有霉菌毒素的飼糧時，日糧核苷酸的補充并不影響機體MDA的生成。結果發現日糧核苷酸對削弱免疫細胞中因T-2毒素誘發的DNA損傷具有功效，這表明補充日糧核苷酸對霉菌毒素中毒的免疫系統的改善具有有益作用。

關鍵詞：霉菌毒素，T-2毒素；嘔吐毒素；核苷酸；DNA損傷；脂質過氧化

中圖分類號：S816.7 文獻標識碼：A 文章編號：1001-0769（2014）05-0070-04

1 引言

鐮刀菌屬霉菌產生的單端孢霉烯類毒素，如T-2毒素、HT-2毒素、嘔吐毒素和雪腐鐮刀菌烯醇對谷物食品和飼料的污染，對于北溫帶地區的國家生活的人類或者動物是一個健康威脅（Hussein和Brasel，2001；Creppy，2002）。

單端孢霉烯類毒素所引起的慢性中毒狀主要表現有：厭食癥，體增重降低，營養效率減小，內分泌紊亂，免疫力減弱（Larsen等，2004）。相比于其他物種，家禽對單端孢霉烯類毒素敏感性較弱。當飼料中的嘔吐毒素水平超過5 mg/kg將會對動物產生不利影響（Danicke等，2001），而超過10 mg/kg將導致動物拒食和體增重降低（Danicke等，2003）。當飼料中的嘔吐毒素水平達到10 mg/kg時，飼養肉雞的腸道功能會減弱（Awad等，2004），肌胃、法氏囊和心臟的相對器官重量增加（Kubena等，1997），體液免疫受到影響（Oswald等，2005），并且血液生化指標的參數改變（Kubena等，1988）。與嘔吐毒素相似，低劑量T-2毒素會導致動物生產性能下降和嚴重的口腔疾病，增加肌胃相對重量，降低法氏囊的相對重量（Kubena等，1994；Raju和Devegowda，2000；Garcia等，2003）。Grabarevic等（1992）報道了感染了T-2毒素后的雞在心臟，肝臟，十二指腸和腎臟組織病理學變化，而且Boonchuvit等（1975）報道了感染了T-2毒素后的雞會導致機體產生免疫抑制。飼喂被鐮刀菌屬霉菌毒素污染的谷物類原料比例過高的日糧，肉雞的B、T淋巴細胞的比例會降低，但不影響血清免疫球蛋白濃度（Swamy等，2004）。

單端孢霉烯類毒素的毒性是由不同的作用機制所誘導的。主要作用機理在于：單端孢霉烯類毒素能結合在真細胞的60 S核糖體亞基上，從而導致蛋白質、DNA和RNA的合成受到抑制（Eriksen和Pettersson，2004）。此外，有研究表明單端孢霉烯類毒素會刺激機體產生脂質過氧化，引起細胞膜受損和DNA損傷（Atroshi等，1997；Leal等，1999；Vila等，2002；Minervini等，2005）。由于自身的氧化途徑的激活或DNA加合物的形成及遺傳單鏈和雙鏈的DNA斷裂，并沒有研究表明T-2毒素和嘔吐毒素對于家禽具有遺傳毒性效應。Rizzo等（1998）和Atroshi等（1997）認為T-2毒素和嘔吐毒素主要是通過氧化途徑誘導大鼠和小鼠肝臟中的DNA損傷。但是，單端孢霉烯類毒素的遺傳毒性仍有待確定。

雖然核苷酸是半必需營養物質，但是當機體處于某種病理條件下，需要大量的核酸和蛋白的合成時，核苷酸會成為人類和動物的必需營養物質，如胃腸道粘膜的損害修復（Yamauchi等，1998；Holen和Jonsson，2004），免疫細胞的快速增殖（Jyonouchi等，1996；Burr-ells等，2001a，b；Cameron等，2001），肝臟和腦組織的康復（Yamamoto等，1997；Perez等，2004）。

由于沒有充分的證據表明單端孢霉烯類毒素具有遺傳毒性（Tritscher和Page，2004），因此，本研究的目的也在于考察T-2毒素和嘔吐毒素誘導雞體內免疫細胞DNA損傷的潛力，以評估感染雞機體的氧化狀態。關于日糧核苷酸對霉菌中毒癥的影響沒有研究報道。本研究的一個更深層次的目的在于探討日糧核苷酸對白細胞中由霉菌毒素誘導的DNA損傷的保護效果，因為核苷酸的這一作用模式可能增加免疫細胞的增殖，并優化免疫系統的功能。

2 材料和方法

2.1 試驗動物和試驗日糧

試驗選用20日齡的羅斯308雄性肉雞，單籠飼養，環境溫度控制在26 ℃，隨著動物的生長發育逐漸的調低環境溫度，并持續光照。動物自由采食，自由飲水。日糧配方參照NRC（1994）的3～6周齡肉雞的營養需要進行設計。

試驗開始前，將肉雞隨機分為5個處理組（每組10羽），分別飼喂不同飼糧：（1）對照組——飼喂不添加霉菌毒素和核苷酸的基礎日糧；（2）DON組——飼喂在基礎日糧中添加 10 mg/kg嘔吐毒素的飼糧；（3）DON+組——飼喂在基礎日糧中添加10 mg/kg嘔吐毒素和2 mg/kg核苷酸的飼糧；（4）T-2組——飼喂在基礎日糧中添加10 mg/kgT-2毒素的飼糧；（5）T-2組+——飼喂在基礎日糧中添加10 mg/kgT-2毒素和 2 mg/kg核苷酸的飼糧。每周記錄一次動物的耗料量和活體增重。在試驗期的第17天，屠宰試驗肉雞，并采血，采集脾臟和肝臟組織樣品，并考察肝臟、脾臟、腦、腎臟、心臟、肌胃、小腸和法氏囊的相對重量。

2.2 霉菌毒素和核苷酸

購買的T-2毒素和嘔吐毒素的真菌培養物：T-2毒素真菌培養物中含T-2毒素0.49 %（W/W），嘔吐毒素真菌培養物含有1.04 %（W/W）嘔吐毒素。核苷酸由瑞士Chemoforma公司提供的ASCOGEN?制劑，含有酵母中提取的RNA、核苷酸、核苷酸前體物、有機酸。

2.3 化學制品

RPMI 1640培養基，Triton X-100，二甲亞砜（DMSO），N-月桂基肌氨酸鈉，溴化乙錠，EDTAK3，低和正常熔點瓊脂糖購自Sigma（圣路易斯，密蘇里州，美國）。丁基化羥基甲苯（BHT），三氯乙酸（TCA），2-硫代巴比妥酸（TBA），乙醇，甲醇和無機鹽購自Merck（達姆施塔特，德國）。

2.4 白細胞分析和“彗星”分析法檢測DNA

檢測雞脾臟中分離的白細胞的DNA片段。脾臟通過80×48 μm孔徑的尼龍篩浸于大約5 mL的RPMI 1 640培養基（Sigma R-8 758）中，所得到的混合物轉移到1.5 mL離心管和在3 000 r/min下離心5 min。白細胞的沉淀用0.5 mL 10 mM磷酸鹽緩沖液（PBS，pH值為7.2～7.4）混合。“彗星”分析法參照Singh等（1988）進行，并根據Rezar等（2003）的描述進行輕微修改。在Olympus CH50落射熒光顯微鏡（日本）（200·放大率）與附濱松奧卡1 CCD照相機（日本）被用來檢測白細胞的細胞核。圖片是由彗星5計算機軟件（單細胞凝膠電泳，動力學影像有限公司，2000年，英國）進行分析。DNA損傷程度跟據形成的彗星拖尾形象DNA的百分比和OTM值（Olive tail Moment）來評估。

2.5 丙二醛（MDA）的檢測

血漿中的MDA含量的檢測方法參照Wong等（1987），并根據Chirico（1994）進行修改通過HPLC檢測，肝臟中的MDA含量的檢測參照Vila等（2002）。具體步驟見原文。

2.6 谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、總抗氧化水平（TAS）和肝酶檢測

紅細胞中GPx活性的檢測方法參照Paglia和Valentine（1967），血漿TAS的檢測方法參照Miller和Rice Evans（1996），樣品檢測按照試劑盒的說明進行操作。血漿肝酶活性的檢測使用由默克（德國達姆施塔特）提供的試劑盒進行分析：ALT（Granutest? 3，12166），AST（Granutest? 3，12150），GGT（Granu-test? 3，12189）。

2.7 統計分析

試驗數據采用SAS/STAT模塊（SAS 8e，2000；SAS Inc.，Cary，NC，USA）的GLM模型進行分析，結果以LS-Mean±SEM（最小二乘均數±標準誤）表示，組間采用T檢驗進行多重比較，以P<0.05作為具有顯著性差異。

3 結果

3.1 體增重、采食量和器官的相對重量

飼糧中含有T-2毒素的處理組的體增重比對照組低 47 %（表1）。飼喂含有T-2毒素飼糧的處理組生長受阻是由于采食量的顯著降低引起的。與飼喂含量T-2毒素的飼糧相比，飼喂含有10 mg/kg的嘔吐毒素飼糧對采食量和體增重的降低處于一個較小的范圍（表1）。當飼糧被T-2毒素和嘔吐毒素污染時，補充日糧核苷酸并不會提高動物的采食量和體增重。

飼糧中含有T-2毒素的處理組和T-2毒素+核苷酸的處理組肉雞的腎臟、肌胃、腦和小腸的相對重量（g/100g BW）增加（表2）。在飼糧含有T-2毒素處理組中，補充核苷酸能增加17 %的大腸相對重量，減少11 %的心臟相對重量。各霉菌毒素處理組間的肝臟、脾臟、法氏囊和胰臟的相對重量沒有差異（數據未列出）。無論添加或不添加核苷酸，嘔吐毒素處理組肉雞腎臟、大腸、肌胃和腦的相對重量并沒有顯著性效應。

3.2 脾臟白細胞的DNA損傷

DNA損傷程度根據形成的彗星拖尾形象DNA的百分比和OTM值（Olive tail Moment）來表示，OTM值表示尾部DNA占總DNA的百分比與頭、尾部中心間距的乘積，OTM值越大表示DNA損傷程度越大（Olive等，1992）。與對照組相比，飼糧中含有T-2毒素和嘔吐毒素都會顯著提高拖尾DNA的百分比。補充日糧核苷酸只顯著降低T-2毒素組的拖尾DNA百分比（圖1）。DON、DON+組與對照組間的OTM值沒有差異，然而與對照組相比，T-2組顯著提高了OTM值，但補充日糧核酸的T-2+組能將OTM值又降低到與對照組相同的水平 （圖2）。

3.3 氧化狀態和肝酶活性

與對照組相比，飼糧中含有T-2毒素和嘔吐毒素的處理組血液和肝臟中的MDA含量沒有顯著差異；但是T-2組和DON組的血液和肝臟中的MDA含量具有顯著差異（表3）。霉菌毒素處理組間肝臟MDA含量的差異性很大。補充日糧核苷酸并不影響肝臟MDA水平。無論添加或不添加日糧核苷酸，飼糧中含有T-2毒素的處理組肉雞血液TAS都會降低，但是飼糧中含有嘔吐毒素并不會改變所飼養肉雞血漿TAS（表3）。另一個體現機體氧化應激的指標——GPx活力在各個處理組間的差異不顯著。

血液中的肝酶ALT和GGT水平是不一致的（表4）。可以發現無論添加或不添加日糧核苷酸，飼糧中含有T-2毒素的處理組肉雞血漿AST活性會顯著降低。

4 討論

由于T-2毒素和嘔吐毒素的遺傳毒性的確切的機制沒有得到深入地研究，仍不清楚是哪種單端孢霉烯類霉菌毒素造成DNA的斷裂。他們（霉菌毒素）可能會造成DNA結構被打破，或者通過不同后生的機制（例如DNA堿基氧化或甲基化）來發揮作用；DNA堿基的氧化或甲基化會改變基因的表達和細胞信號傳導，從而導致細胞增殖受到抑制，甚至導致細胞凋亡。在“彗星”試驗中，那些被檢測到的DNA碎片也是由于氧化甲基的切除和修復造成的結果。本研究表明T-2毒素和嘔吐毒素會造成雞脾臟白細胞DNA斷裂，斷裂程度是由“彗星”實驗檢測到的拖尾DNA的百分比表示。然而另外一個也是經常用來表示DNA斷裂程度的參數——OTM值，在本研究結果也反映了只有T-2毒素處理會造成DNA損傷。關于這兩個指標（拖尾DNA百分比和OTM值）到底是那個描述DNA損傷程度更好，一直沒有統一的意見。拖尾DNA百分比是一個基礎而又最有效的參數，因為它能夠與斷裂頻率之間建立線性關系，并且盡可能地使鑒別的DNA損傷程度控制一個最廣泛的區間（0 %～ 100 %），但是尾距與損傷量之間并不遵守線性關系（Collins，2004）。然而很多科學家更喜歡OTM值，因為這個參數是根據很多基本參數計算出來的綜合指標（Olive等，1992）。Atroshi等（1997）和Rizzo等（1998）的報道能夠支持本研究的發現，前者報道了飼喂T-2毒素會增加小鼠肝臟DNA的損傷程度，后者檢測到T-2毒素和嘔吐毒素對大鼠肝臟細胞具有遺傳毒性的效應。在本研究中T-2毒素能誘導更大程度的DNA損傷，T-2毒素也被證實不僅僅具有比嘔吐毒素更強的細胞毒性（Nasri等，2006），而且具有更強的遺傳毒性。大量研究表明T-2毒素和嘔吐毒素會造成機體組織自由基的生成，從而引起脂質過氧化（Karppanen等，1989；Rizzo等，1994；Guerre等，1998；Leal等，1999；Vila等，2002）。本研究的結果表明，T-2毒素和嘔吐毒素不改變血漿中的MDA（脂質過氧化指標）的含量，并且對肝臟MDA含量產生不同的作用，這與以前關于脂質過氧化的研究發現并不完全一致。值得一提的是，與本研究相比，以前關于T-2毒素和嘔吐毒素誘導脂質過氧化和DNA損傷的研究中所飼喂的霉菌毒素劑量更高。Schuster等（1987）推斷T-2毒素不會影響大鼠肝臟中的硫代巴比妥反應物質的生成，這與本研究的結果相似。T-2毒素處理組肉雞血液中的TAS顯著減低，表明T-2毒素會誘導機體產生氧化應激，但是這點不被GPx活力的檢測結果所支持。在另外一個方面，飼糧中添加10 mg/kg的嘔吐毒素并不改變機體的TAS和GPx活力。

霉菌中毒癥引起血漿中肝酶（ALT，AST和GGT）含量的增加，被認為是因為造成肝細胞惡化之后造成肝酶泄漏，從而進入血液循環。由于毒素處理組的血漿肝酶含量太低不足以說明肝毒性的產生，并且肉雞的肝臟相對重量與對照組相比沒有差異，因此，可以假定本研究中肝臟并沒有受到激烈的損傷。Danicke等（2003）和Harvey等（1997）的報道均能支持本研究的試驗數據，前者報道了飼糧中添加21 mg/kg的嘔吐毒素對雞血液肝酶水平沒有顯著影響，后者報道了嘔吐毒素處理對肉雞的能表明肝臟損傷的血清參數并沒有影響。

由于毒素處理組的脾臟和法氏囊相對重量發生改變，可以預測這是免疫器官產生故障的一個信號。已有報道指出霉菌毒素對免疫器官的存在這種影響：飼喂T-2毒素的小鼠試驗（Vila等，2002）和飼喂嘔吐毒素的雞試驗（Danicke等，2003）。目前的研究表明T-2毒素和嘔吐對脾臟和法氏囊相對重量沒有影響。然而，無論是否額外補充日糧核苷酸，T-2毒素處理組肉雞的肌胃、小腸、腎臟和腦的相對重量提高，可以認為是由于這些器官受到刺激或作用功能加劇造成的結果。在Chi等（1977），Harvey等（1997）和Danicke等（2003）的試驗研究中，當添加嘔吐毒素或T-2毒素時，心臟的相對重量增加或不變，這與本研究中T-2毒素處理減少了心臟相對重量的結果相矛盾。顯然，那些文獻和本研究中所用的單端孢霉烯類霉菌毒素的劑量遠超出了能改變器官相對重量的劑量（Kubena等，1997；Harvey等，1997）。

目前的研究結果表明，核苷酸在被T-2毒素污染了的飼糧中添加是能夠削弱動物體內白細胞DNA由這種霉菌毒素誘導的損傷。核苷酸在被嘔吐毒素污染了的飼糧中添加也能觀察到具有相同的趨勢，雖然這種差異并不具有顯著性。T-2毒素比嘔吐毒素表現出更強的遺傳毒性潛力，因而可能補充的核苷酸在DNA損傷程度更大時表現出的效果更好。Salobir等（2005）也得到了類似的研究結果，他發現核苷酸對高脂肪的攝入量引起的豬淋巴細胞DNA氧化損傷具有預防作用。高脂肪攝入量會誘導氧化應激（自由基的形成），這將這引起淋巴細胞DNA斷裂，而核苷酸的補充能夠阻止這種現象的發生。核苷酸本身不是已知的具有抗氧化特性的物質，它對氧化應激指標的改變不能被預期。在阻止T-2毒素或嘔吐毒素介導的脂質過氧化的過程中，核苷酸作用方式可能是通過改善特定RNA的合成，這種特定的RNA又將負責特定酶的合成，這種特定的酶對抗氧化應激又是必需的。補充了核苷酸的T-2毒素處理組TAS和GPx活力過低，不能支持這一假設。此外，在T-2毒素和嘔吐毒素處理組中補充核苷酸并沒有改變這兩種霉菌毒素對AST、ALT和GGT水平的影響。

本研究的結果表明，與能代表B型的單端孢霉烯類霉菌毒素——嘔吐毒素相比，A型的單端孢霉烯類霉菌毒素——T-2毒素對雞脾臟白細胞更具遺傳毒性。并不排除氧化途徑可能僅僅是鐮刀菌毒素誘導DNA斷裂的作用機制之一。總之，本研究所得的結果表明，日糧核苷酸能夠削弱由T-2毒素作用造成免疫細胞DNA損傷的風險，這表明補充日糧核苷酸可能對霉菌毒素中毒的免疫系統的改善具有有益作用。關于核苷酸在修復霉菌毒素誘導的DNA損傷中的作用需要更深入的研究。□□

原題名：The role of dietary nucleotides in reduction of DNA damage induced by T-2 toxin和deoxynivalenol in chicken leukocytes（英文）

原作者Franki? T、Pajk T、Rezar V、T. Rezar、A. Levart、J. Salobir