白術茯苓湯高中低劑量對脾虛型克羅恩病大鼠血清TNF—α和IL—1、IL—6的影響

鐘強等

【摘要】目的：考察白術茯苓湯高中低劑量對脾虛型克羅恩病（CD）大鼠促炎因子的影響；初步探討該方治療脾虛CD的最佳有效劑量。方法：采用破氣耗氣加饑飽失常之復因脾虛造模方法結合Morris方法復制脾虛型CD大鼠動物模型，白術茯苓湯高中低劑量灌胃給藥，酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測大鼠血清腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）含量。結果：與空白組相比，模型組TNF-α、IL-1、 IL-6升高（P<0.05）；與模型組相比，高劑量組TNF-α、IL-1降低（P<0.05）；中劑量組TNF-α、IL-1、 IL-6降低（P<0.05）；低劑量組TNF-α降低（P<0.05）。結論：白術茯苓湯高中低劑量對脾虛型克羅恩病（CD）大鼠促炎因子的影響不同。其中白術茯苓湯中劑量組對TNF-α、IL-1、 IL-6的調節作用全面且優于高劑量組和低劑量組。

【關鍵詞】白術茯苓湯；脾虛型克羅恩病；影響

【中圖分類號】R222 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949（2014）04-0223-01

克羅恩病（Crohns disease， CD）是一種病因及發病機制尚未明確的慢性非特異性炎性腸病（IBD），病變主要影響結腸粘膜，且以潰瘍為主。目前認為CD的發病是遺傳和環境因素相互作用的結果，且與免疫功能異常密切相關。西醫治療主要使用水楊酸類、類固醇類和免疫抑制劑等以控制急性發作，緩解病情，減少并發癥等，但療效不穩定。迄今尚未有任何一種療法被認為是治療CD的特效療法。現今，中醫辨證論治以及中西醫結合治療對其有著較好療效[1]。研究表明CD的病機特點為脾虛夾濕[2]。白術茯苓湯由白術、茯苓組成，具有健脾祛濕的功效。是治療脾胃氣虛證、脾虛濕滯證等的經典小方和常用藥對[3]。本研究觀察了白術茯苓湯高中低劑量對脾虛型CD大鼠血清TNF-α、IL-1、 IL-6水平的影響，探索白術茯苓湯高中低劑量調控脾虛型CD大鼠細胞因子的藥效相關性，為中醫方劑劑量配比理論提供一定的實驗基礎。

1材料與方法

1.1 動物

SPF級SD（Sprague Dawley）大鼠50只，由成都達碩生物科技有限公司提供，合格證號：SCXK（川）2008-11，雌雄各半，體重200±20g，檢疫后備用。適應性飼養1周，自由攝食顆粒飼料，動物房溫度維持在18-25℃左右。成都中醫藥大學基礎醫學院SPF級動物實驗室進行，設施合格證：川實動管使第2003-015號。

1.2 藥材與試劑

白術、茯苓、大黃、厚樸、枳實均購自同仁堂成都分店，經成都中醫藥大學制劑室鑒定為正品。

2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）購自Sigma公司，批號：P2297。進口分裝腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）定量試劑盒（LOT：201106）、白介素-1（Interleukin-1，IL-1）定量試劑盒（LOT：201106）、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）定量試劑盒（LOT：201106）由成都亞芯科技有限公司提供。

1.3 供試藥物制備

1.3.1 中藥湯劑的制備

稱取藥材，浸泡30min，共煎煮2次，每次30min，合并濾液，60℃恒溫水浴濃縮至1g/ml，經0.45μm微孔濾膜過濾除菌，4℃保存備用。

1.3.1.1 小承氣湯的配比

厚樸：枳實：大黃為3：3：2。

1.3.1.2 白術茯苓湯的高中低劑量

大鼠用藥劑量按照國家中醫藥管理局的相關規定，人鼠單位體重用藥量直接換算后的5、10、20倍為低、中、高劑量[4]。

1.3.2 TNBS灌腸液的制備

無水乙醇加雙蒸餾水配成50%乙醇75ml，然后將5%TNBS10ml×15與50%乙醇（2：1=V：V）混合均勻，滅菌后裝瓶4℃保存。

1.4 脾虛型CD動物模型制備

本實驗采用破氣耗氣加饑飽失常之復因脾虛造模法[5]結合Morris方法[6]建立脾虛型CD動物模型。50只SD大鼠，全部雄性，按體重隨機分為2批，10只常規飼養，為空白組，40只造模。空白組10只，常規飼養；40只造模大鼠采用小承氣湯按20ml（kg/d），1次/d的劑量灌胃，加隔天禁食造成饑飽失常，連續14d，復制脾虛模型。并于造模第7d開始禁食不禁水24h，用2%戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔注射麻醉，予TNBS灌腸液1ml灌腸。灌腸器插入肛門約6cm-8cm，注入灌腸液1ml。大鼠頭朝下體位，且灌腸器拔出后再繼續保持1min左右，以防灌腸液流出。每隔5d重復灌腸1次，共5次。

1.5 實驗分組及給藥方法

造模結束后，造模大鼠隨機分為1個模型組、白術茯苓湯高、中、低劑量組。空白組從實驗開始至實驗結束正常喂食、飲水；模型組灌胃等量0.9%生理鹽水，1次/d，連續7d，白術茯苓湯高中低劑量組按10ml/kg灌胃，1次/d，連續5d。

1.6 標本采集與處理

各組實驗大鼠在第38d禁食不禁水24h，股動脈取血處死。取血后不抗凝4℃靜置保存2-3h，用離心機2500r/min離心15min，取上清液為待測樣本。用ELISA法測定血清中TNF-α、IL-1、IL-6水平。

1.7 統計學方法

所有數據用SPSS13.0統計軟件處理，組間計量資料比較采用單因素方差分析法，結果以均數±標準差（ X±s）表示，

2結果

2.1 脾虛型CD大鼠一般情況

造模后各組大鼠均出現腹瀉、粘液膿血便、肛周大量糊狀稀便黏附、食量減少、形體消瘦、毛發干枯、喜靜愛扎堆。白術茯苓湯高中低劑量組經治療后，高、低劑量組大鼠仍有少量稀便、粘液便、肛周糊有少量稀便；中劑量組大鼠大便基本恢復正常，肛周逐漸干凈，體重增加。

2.2 各組大鼠血清細胞因子水平的變化比較（表1）

3 討論

CD在中醫學中尚無某一病名與之對應，根據其臨床表現，常將其歸屬于“泄瀉”、“腸澼”、“腹痛”、“痢疾”、“便血”等范疇。臨床觀察發現該病基本病機為脾虛夾濕。脾主運化，喜燥惡濕，脾虛氣弱常既發水濕停滯的病變，若飲食不節或情志不遂等致脾胃損傷，脾不運濕，水濕停滯，濕濁下注腸道，則發為泄瀉，正如《素問.藏氣法時論》謂：“脾病者……虛則腹滿，腸鳴饗泄，食不化。”濕滯腸間，搏結氣血，氣血運行不暢，血肉腐敗，則見腹痛、便血等。脾虛夾濕是CD的基本病機之一，治當健脾祛濕。白術茯苓湯出自《古今醫統大全》，為“治濕瀉，又治食積、濕熱作瀉”之基礎方。方中白術益氣健脾兼能燥濕，茯苓淡滲利濕兼可健脾，二藥相配，相須為用，既加強了益氣健脾以助運化的作用，其燥濕滲濕作用又顧及了脾不運濕、濕濁下注之病變。在方劑學研究中，藥對配伍是方劑配伍的基礎，劑量配比是方劑研究的基礎，因此本研究采用白術茯苓湯高中低劑量配比的實驗設計，旨在探索白術茯苓這一基本藥對的高中低劑量配比對脾虛型CD大鼠治療的藥效相關性。

西醫學中CD為慢性肉芽腫性炎癥，病變可累及胃腸道各部位，以回腸末端及其鄰近結腸為主。其發生普遍認為與環境、感染、遺傳以及免疫等多種因素綜合作用所致[7]。TNF-α、IL-1、 IL-6等細胞因子已被公認是介導IBD發病的促炎因子，在IBD患者的結腸粘膜中，炎性細胞因子如IL-1β、TNF-α、 IL-6升高。本研究結果顯示與正常組比較，脾虛型CD模型大鼠血清中促炎因子TNF-α、IL-1、 IL-6水平明顯升高（P<0.05），白術茯苓湯高中低劑量配比各組與模型組大鼠血清TNF-α、IL-1、 IL-6比較，高劑量組TNF-α、IL-1降低（P<0.05）；低劑量組TNF-α降低（P<0.05）；中劑量組TNF-α、IL-1、 IL-6降低（P<0.05）。

本次研究提示脾虛型CD大鼠血清中TNF-α、IL-1、 IL-6水平明顯增高，而白術茯苓湯高中低劑量配比中，尤以中劑量組下調TNF-α、IL-1、 IL-6水平最為突出和均衡，提示茯苓白術湯劑量對脾虛型CD療效的影響為非正比關系，當茯苓白術湯劑量逐漸增加至一定水平時，藥物作用達到最佳，繼續增加藥物劑量，藥物的作用反而會降低，以此印證在臨床藥效關系中，適當的藥物劑量才會發揮最佳的治療作用。

參考文獻

[1] 嚴寧娟. 克羅恩病中西醫研究進展 [D].北京：北京中醫藥大學，2007：31-35.

[2] 李乾構，周學文，單兆偉. 中華中醫藥學會內科脾胃病第十四次學術交流會論文匯編[C].山西，2002：2，3，264-266，270.

[3] 賈波，梁煜.補氣健脾組方規律的文獻及實驗研究 [J].中國醫藥學報，2003，8（1）：35-37.

[4] 李儀奎，王欽茂.中藥藥理實驗方法學[M].上海：上海科學技術出版社，1991：61.

[5] 周永生，樊雅莉，陳小野，等.脾氣虛證動物模型規范化的初步研究—部分免疫功能方面 [J].實驗動物科學與管理，2003，20（2）：1-5.

[6] Morris GP， Beck PL， Herridge MS， et al. Hapten in-duced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon [J]， Gastroenterology，1989，96：795-803

[7] Hanauer SB. Inflammatory bowel disease： epidemio-logy，pathogenesis，and therapeutic opportunities [J]， Inflamm Bowel Dis，2006（12）：3-9.