依達拉奉對谷氨酸所致神經干細胞損害的保護作用

盧 藝* 鄒良玉 褚曉凡 張 瑩 付學軍

（暨南大學第二臨床學院深圳市人民醫院，廣東 深圳 518020）

依達拉奉對谷氨酸所致神經干細胞損害的保護作用

盧 藝* 鄒良玉 褚曉凡 張 瑩 付學軍

（暨南大學第二臨床學院深圳市人民醫院，廣東 深圳 518020）

目的 探討依達拉奉對谷氨酸所致神經干細胞損害的保護作用及機制。方法 取大鼠13.5 d胚胎皮質，提取神經干細胞，分為谷氨酸處理組（500 μmol/L）、依達拉奉干預組（500 μmol/L谷氨酸+500 ng/mL依達拉奉）和正常對照組。谷氨酸及依達拉奉處理24 h后，應用光學顯微鏡高倍下觀察各組細胞的形態和數量；并對各組細胞作DAPI及TUNEL染色，計數陽性細胞。結果 與正常對照組比較，谷氨酸處理組細胞的數量減少（P＜0.05）；依達拉奉組細胞的數量較谷氨酸組明顯增多（P＜0.05）。谷氨酸處理組的TUNEL陽性細胞明顯多于正常對照組（P＜0.05），依達拉奉組的TUNEL陽性細胞明顯少于谷氨酸組（P＜0.05）。結論 依達拉奉通過拮抗谷氨酸誘導的細胞凋亡對谷氨酸所致的神經干細胞損害起到保護作用。

神經干細胞；凋亡；依達拉奉

中樞神經系統發生缺血、缺氧引發神經細胞死亡，由此釋放的谷氨酸會導致谷氨酸受體大量激活，鈣離子通過激活的谷氨酸受體大量流入細胞內，導致氧化應激反應的發生，其可導致更多的神經細胞損害[1]。依達拉奉是有效的自由基清除劑，大量的臨床研究證實其可以改善急性缺血性腦卒中的神經損害癥狀以及恢復期的日常生活能力。其作用機制主要為抑制脂質過氧化反應、減輕腦內花生四烯酸引起的水腫[1,2]。但依達拉奉能否通過抑制興奮性神經遞質，如谷氨酸的神經損害目前尚無報道。本研究觀察依達拉奉對谷氨酸損害的神經干細胞的抗凋亡作用，以探討依達拉奉神經保護作用的多靶點機制。

1 材料與方法

1.1 材料

孕13.5 d的SD大鼠2只（廣東省實驗動物監測所提供）。DMEM培養液(Gibco公司)，N2、B27(Sigma公司)，BFGF（Sigma公司），6孔、24孔細胞培養板(Costar公司)，TUNEL染色試劑盒(Roche公司)，Nestin抗體（碧云天）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與分組

將2只孕13.5 d的SD大鼠吸入二氧化碳麻醉處死后，75 %酒精消毒腹部皮膚，取出12只胚胎，將胚胎置于DMEM溶液中，顯微鏡下取出胚胎皮層，置于15 mL離心管中，經過反復的抽吸，得到懸浮的單細胞，將其種植于細胞培養板。培養條件為37 ℃、5 % CO2和95 %空氣、飽和濕度，用含B2、N27、BFGF(Basic Fibroblast Growth Factor堿性成纖維細胞生長因子)的DMEM人工培養基培養，當細胞匯集接近滿瓶時，用0.05 %胰蛋白酶消化，離心，收集細胞。細胞鑒定，用神經細胞特異免疫熒光染色檢測法測神經干細胞特異性蛋白——巢蛋白（Nestin蛋白）。Nestin蛋白是第6類中間絲骨架蛋白，定位于干細胞的細胞質，已被廣泛用作神經干細胞的標志物。在培養基中，NSCs（神經干細胞）呈球團狀懸浮生長，神經上皮干細胞巢蛋白表達陽性[3,4]。證實所培養細胞中神經干細胞占95 %以上后繼續實驗。將細胞均勻接種于6孔培養板和24孔培養板，分為谷氨酸處理組、依達拉奉干預組和正常對照組，每個實驗組6個復孔。

1.2.2 細胞模型建立與處理

谷氨酸處理組和依達拉奉干預組的細胞培養液中加入谷氨酸（終濃度為500 μmol/L），誘導神經干細胞損傷[5]。同時在依達拉奉干預組的細胞培養液中加入依達拉奉（濃度為500 ng/mL）。正常對照組的細胞培養液中加入等量的生理鹽水。

1.2.3 細胞形態、數量觀察

各組細胞藥物處理后培養24 h，用光學顯微鏡（奧林巴斯）高倍鏡下進行拍照，觀察5個視野，觀察細胞的形態和數量。

1.2.4 DAPI染色與TUNEL染色

各組細胞藥物處理后培養24 h，對各組細胞進行DAPI與TUNEL雜色。在熒光顯微鏡下觀察，觀察5個視野，計數高倍視野下DAPI與TUNEL染色陽性的細胞數。

1.2.5 統計學方法

采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學處理，檢測結果以均數±標準差（）表示，組間比較采用方差分析及ANOVA檢驗。

2 結 果

2.1 谷氨酸處理組、依達拉奉干預組及正常對照組神經干細胞形態及數量比較

結果顯示：谷氨酸組的細胞數量較正常對照組減少。依達拉奉組的細胞數量較谷氨酸組增多（圖1、表1）。

圖1 谷氨酸處理組、依達拉奉干預組及正常對照組神經干細胞形態及數量比較。①、③、⑤為10倍鏡下所見；②、④、⑥為40倍鏡下所見

表1 谷氨酸處理組、依達拉奉干預組及正常對照組神經干細胞形數量比較

2.2 谷氨酸處理組、依達拉奉干預組及正常對照組TUNEL陽性細胞比較

DAPI與TUNEL染色分別用于標記活細胞和凋亡細胞。結果顯示：正常對照組出現少量TUNEL陽性細胞；與正常對照組比較，谷氨酸處理組TUNEL陽性細胞明顯增多（P＜0.05）；與谷氨酸處理組比較，依達拉奉組的TUNEL陽性細胞明顯少于谷氨酸組（P＜0.05）。見圖2、表2。

3 討 論

本實驗使用的DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚）是一種能夠與DNA強力結合的熒光染料。當DAPI可以透過完整的細胞膜與雙股DNA結合時，熒光顯微鏡觀測藍色至青綠色，示活細胞。TUNEL（原位末端轉移酶標記技術）基因組DNA斷裂時，暴露的3'-OH可以在TdT(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase，末端脫氧核苷酸轉移酶)的催化下加上熒光素(FITC)標記的dUTP。熒光顯微鏡觀測呈黃綠色，示細胞凋亡。

本研究發現：興奮性氨基酸谷氨酸對于神經干細胞有顯著的損傷作用，其損傷作用可能通過誘導細胞凋亡產生，依達拉奉通過抑制谷氨酸誘導的凋亡過程達到保護神經干細胞的作用。

腦缺血后細胞死亡是一個多通道的過程，興奮性氨基酸的過度活躍對于腦缺血后的細胞損傷有明顯的放大作用。中樞神經系統發生缺血引發神經細胞死亡，由此釋放的谷氨酸會導致谷氨酸受體大量激活，鈣離子通過激活的谷氨酸受體大量流入細胞內，導致氧化應激反應的發生，其可導致更多的神經細胞損害[1]。但依達拉奉能否通過抑制興奮性神經遞質，如谷氨酸的神經損害目前尚無報道。研究發現在急性腦梗死發生后，大量的神經干細胞在腦室下區出現，這些神經干細胞的出現對于神經修復意義重大[6-9]。但由于谷氨酸等興奮性氨基酸的過量釋放，導致大量神經干細胞死亡，影響了腦組織的自然修復[5]。本研究證實了谷氨酸對于神經干細胞的細胞毒性。除此之外，本研究發現谷氨酸對于神經干細胞的細胞毒性源于谷氨酸對于神經干細胞凋亡過程的誘導作用。

圖2 谷氨酸處理組、依達拉奉干預組及正常對照組TUNEL陽性細胞比較（DAPI染色用于標記活細胞，在熒光顯微鏡鏡下顯示藍色至青綠色；TUNEL——原位末端轉移酶標記技術，用于標記凋亡細胞，在熒光顯微鏡鏡下顯示黃綠色。圖①～⑨均為40倍鏡下所見）

表2 谷氨酸處理組、依達拉奉干預組及正常對照組TUNEL陽性細胞比較

依達拉奉是目前臨床試驗證明唯一有效的自由基清除劑。對于急性腦梗死，其通過捕獲自由基，抑制腦細胞(神經細胞，血管內皮細胞)的過氧化作用[10,11]，從而達到減輕腦水腫和腦組織損傷的作用。由于其獨特的清除自由基和減輕缺血再灌注的作用機制[12]，適應證還擴大到心肌、腎臟和肺缺血再灌注，肝臟、腸缺血等。本課題組之前的研究[13]顯示，對谷氨酸作用損傷的神經干細胞，依達拉奉可以抑制其caspase-3的表達，并減少細胞的受損的數量，但是否可以減少凋亡細胞的數量尚未明確。在這個研究基礎上，本研究探討依達拉奉保護神經干細胞的機制，以TUNEL染色作為確定凋亡細胞數量的標準。研究發現，谷氨酸組的神經干細胞數量減少細胞受到明顯損害。而依達拉奉干預組的細胞數量較谷氨酸組顯著增加，細胞損害較輕。TUNEL染色示依達拉奉干預組的凋亡細胞數量較谷氨酸組明顯減少。表明依達拉奉干預可以減輕谷氨酸氧化應激反應導致的神經干細胞損傷，降低神經干細胞的凋亡。結合之前的實驗結果，依達拉奉干預可抑制caspase-3的表達，阻斷細胞凋亡的信號轉導通路，減少細胞的凋亡，而起到神經保護的作用。

[1] Yamawaki M,Sasaki N,Shimoyama M,et al.Protective effect of edaravone against hypoxia - reoxygenation injury in rabbit cardiomyocytes[J].Br J Pharmacol,2004,142(3): 618.

[2] Ito K,Ozasa H,Horikawa S.Edaravone protects against lung injury induced by intestinal ischemia-reperfusion in rat[J].Free Radic Biol Med,2005,38(3): 369-374.

[3] Lendahl U,Zimmerman LB,mckkay RD.CNS stem cells express anew class of intermediate filament protein[J].Cell,1990,60(4):585-595.

[4] 潘良春,尹宗生,王偉,等.胚胎和新生大鼠神經干細胞培養與分化的特性比較[J].中國臨床康復,2006,10(5):25-27.

[5] 崔俐,張巨,林衛紅,等.谷氨酸對體外培養胎鼠神經干細胞的損傷作用[J].吉林大學學報,2009,35(3):451-455.

[6] Jin K,Sun Y,Xie L,et al.Directed migration of neuronal precursors into the ischemic cerebral cortex and striatum[J].Mol Cell Neurosci, 2003,24(1): 171-189.

[7] Zhang RL,Zhang ZG,Zhang L,et al.Proliferation and differentiation of progenitor cells in the cortex and the subventricular zone in the adult rat after focal cerebral ischemia[J].Neurosci,2001,105(1):33.

[8] Li Y,Chen J,Chopp M.Cell proliferat ion and differentiation from ependymal,subependymal and choroid plexus cells in response to stroke in rats[J].J Neurol Sci,2002,193(2): 137-146.

[9] Takasawa K,Kit agawa K,Yagita Y,et al.Increased proliferation of neural progenitor cells but reduced survival of new born cells in the contralateral hippocampus after focal cerebral ischemia in rat s [J].J Cereb Blood Flow Metab,2002,22(3): 299-307.

[10] Yamamoto T,Yuki S,Watanabe T,et al.Delayed neuronal death prevented by inhibition of increased hydroxyl radical formation in a transient cerebral ischemia[J].Brain Res,1997,762(12):240.

[11] Mizuno A,Umemura K,Nakashima M.Inhibitory effect of MCI-186,a free radical scavenger,on cerebral ischemia following rat middle cerebral artery occlusion[J].Gen Pharmacol,1998,30(4):575.

[12] Doi K,Suzuki Y,Nakao A,et al.Radical scavenger edaravone developed for clinical use ameliorates ischemia / reperfusion injury in rat kidney[J].Kindey Int,2004,65(6):1714.

[13] 盧藝,張瑩,褚曉凡,等.依達拉奉抗谷氨酸誘導神經干細胞凋亡作用的實驗研究[J].海南醫學雜志,2011,22(2):23.

Protective Effects of Edaravone on Neural Stem Cells Injury Induced by Glutamate

LU Yi, ZOU Liang-yu, CHU Xiao-fan, ZHANG Ying, FU Xue-jun
(Shenzhen People's Hospital of Second Clinical College of Jinan University, Shenzhen 518020, China)

Objective To investigate the protective effects of Edaravone on neural stem cells (NSCs) injury induced by Glutamate. Methods NSCs were cultured from 13.5 d SD rat embryo, and divided into 3 groups: Glutamate group (500 μmol/L), Edaravone group (500 μmol/L glutamate +500 ng/mL edaravone ) and control group. 24 h after treatment, number of NSCs were observed under an optical microscope. TUNEL staining positive cells were counted under fluorescence microscope. Results Compared with the control group, NSCs in the glutamate groups damaged severely and the NSCs number was significantly lower (P＜0.05);while in edaravone group, NSCs in the glutamate groups damaged wildly and the NSCs number was significantly higher than that in the glutamate group (P＜0.05). Compared with the control group, the number of TUNEL staining positive cell in the glutamate groups was significantly higher (P＜0.05);while in edaravone group, the number of TUNEL staining positive cell was significantly lower than that in the glutamate group (P＜0.05). Conclusion Edaravone has a protective effect against injury induced by Glutamate on NSCs via inhibition of the apoptosis process.

Neural stem cells; Apoptosis; Edaravone

R971

：B

：1671-8194（2014）04-0018-03

*通訊作者：E-mail:1049328794@qq.com