埃他卡林對內皮素?1誘導的原代培養人肺動脈內皮細胞eNOSmRNA和蛋白表達水平的影響

梅宏波 左祥榮 嚴星

埃他卡林對內皮素?1誘導的原代培養人肺動脈內皮細胞eNOSmRNA和蛋白表達水平的影響

梅宏波 左祥榮 嚴星

目的研究新型ATP敏感性鉀通道（KATP）開放劑埃他卡林（IPT）對內皮素?1（ET?1）誘導的原代培養人肺動脈內皮細胞（HPAECs）內皮型一氧化氮合酶（eNOS）mRNA和蛋白表達水平的影響。方法原代培養HPAECs，對照組不予干預，實驗組分別加入ET?1，ET?1＋IPT、KATP開放劑吡那地爾（PIN）或KATP阻斷劑格列本脲（GLI）等孵育。用RT?PCR技術，分析各組eNOSmRNA表達；采用Western?blot技術，分析各組eNOS蛋白表達。結果ET?1使HPAECs eNOSmRNA和蛋白表達水平下調。IPT呈濃度依賴性抑制ET?1的作用。GLI逆轉IPT的作用。結論長期低氧導致肺血管內皮細胞功能障礙，一氧化氮（NO）生成減少、eNOSmRNA和蛋白水平表達下降，而IPT可改善內皮細胞功能障礙，增加eNOS的表達和NO的釋放，從而降低肺動脈壓力，可能成為較有前途的治療肺動脈高壓（PAH）的新型化合物。

埃他卡林；內皮素?1；KATP通道；人肺動脈內皮細胞

低氧性肺動脈高壓（hypoxic pulmonary hypertension，HPH）是指正常人移居高原后，由于缺氧，引起肺小動脈功能及器質性改變，從而導致肺動脈壓力增高的病癥［1］。

研究發現血管內皮細胞產生的一氧化氮（NO）在HPH的發生機制中起重要調節作用。NO是一種氣體分子，通過舒張血管、抑制血小板聚集和白細胞黏附、抑制血管平滑肌細胞增殖、抑制內皮素?1（ET?1）分泌、清除氧自由基等多種途徑抗肺動脈高壓（PAH）。一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）是NO合成中重要的限速酶，通常將NOS分為3型：內皮型（eNOS或NOS3）、神經型（nNOS或NOS1）和誘生型（iNOS或NOS2）［2?3］。長期低氧可導致eNOS基因和蛋白的表達水平下調。王慧等［3］研究發現具有我國自主知識產權的新型KATP開放劑埃他卡林（iptakalim，IPT）可拮抗長期低氧誘導的大鼠肺組織eNOSmRNA和蛋白表達下調。

本研究應用逆轉錄?聚合酶鏈反應（RT?PCR）和Western?blot技術，進一步了解IPT對ET?1誘導的原代培養人肺動脈內皮細胞（HPAECs）eNOSmRNA和蛋白表達水平的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑 ET?1（Sigma公司）和IPT（軍事醫學科學院藥理和毒理研究所研制合成）生理鹽水配制；格列本脲（glibenclamide，GLI，Sigma公司，美國）生理鹽水配制后再用氫氧化鈉10μmol／L滴定pH值為8.5；吡那地爾（pinacidil，PIN，Sigma公司），二甲基亞砜和生理鹽水按1∶3配制；胎牛血清（FBS）（GIBCO公司），M199（GIBCO公司），內皮細胞生長因子（Sigma公司），RNA Trizol試劑（Invitrogen公司）；DEPC（Sigma公司），逆轉錄試劑盒（TakaRa公司）；2×Taq PCR Master Mix、DNA Marker（北京天根生化科技有限公司）；Rotor?Gene 3000 PCR儀（Corbett Research，Syd?ney，Australia）；eNOS一抗為多克隆兔抗人抗體（Bio?world Technology Inc），二抗為辣根酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG（H＋L）多克隆抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司），內參為HRP標記的單克隆鼠抗人GAP?DH抗體（上海康成生物公司）。預染蛋白Marker（New England Biolab公司），ECL發光液（Cell Signaling Technology）。RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒均為南京碧云天產品。

1.2 方法

1.2.1 原代培養HPAECs：在無菌條件下取因各種原因行肺葉切除術的非肺動脈高壓患者肺葉（經醫院醫學倫理委員會批準及患者知情同意），分離肺動脈，立即置入磷酸鹽緩沖液（PBS）（NaCl 138.0 mmol／L，KCl 5.0mmol／L，Na2HPO40.3mmol／L，KH2PO40.3mmol／L，NaHCO34.0 mmol／L，青霉素105 U／L和Streptomycin 100 mg／L）。沖洗干凈去除紅細胞，無菌鑷翻轉肺動脈使內膜朝外，0.25%胰蛋白酶消化15 min，收集消化液，離心收集細胞，制成細胞懸液按（2～3）×106個／m l接種于含20%FBS的M199培養液的50 ml培養瓶中，37℃5%CO2孵箱（Thermo Scientific Forma公司）培養，每周換液2次，細胞貼壁生長，呈多角形，鋪路石樣外觀；待細胞生長融合＞80%后用0.25%胰蛋白酶消化傳代，傳代后細胞用含10%FBS的M199培養液培養，取4～6代為實驗用細胞。

1.2.2 實驗處理及分組：將生長良好的HPAECs從培養瓶消化下來，調整細胞數至1.8×108／L，接種到6 cm培養皿中培養。實驗用細胞在不含FBS的M199培養液孵育24 h。根據研究目的進行分組。

1.2.2.1 不同濃度IPT對ET?1誘導的eNOSmRNA和蛋白表達水平的影響：對照組A1組（不予干預）；B1組：培養液中加入ET?1 10 nmol／L；C1組：培養液中加入ET?1 10 nmol／L＋IPT 0.1μmol／L；D1組：培養液中加入ET?1 10 nmol／L＋IPT 1.0μmol／L；E1組：培養液中加入ET?1 10 nmol／L＋IPT 10μmol／L。B1、C1、D1、E1組分別孵育12 h。

1.2.2.2 GLI對IPT作用的影響：對照組A2組（不予干預）；B2組：培養液中加入ET?1 10 nmol／L；C2組：培養液中加入ET?1 10 nmol／L＋PIN 10μmol／L；D2組：培養液中加入ET?1 10 nmol／L＋IPT 10μmol／L；E2組：培養液中加入ET?1 10 nmol／L＋PIN 10μmol／L＋GLI10 μmol／L；F組：培養液中加入ET?1 10 nmol／L＋IPT 10 μmol／L＋GLI 10μmol／L。B2、C2、D2、E2、F組分別孵育12 h。

1.2.3 總RNA提取及RT?PCR檢測：用TRIzol法提取各組細胞總RNA，提取的RNA按照逆轉錄試劑盒說明操作進行逆轉錄反應。PCR反應物按照Taq PCR Master Mix反應體系加入。所用引物均由上海細胞生物所合成，加DEPC水溶解，濃度配置成10μmol／L。eNOS上游：5’?GAGTCCTCACCGCCTTCTC?3’；下游：5’?AGGAAGCGGGTGGCAGTA?3’，擴增長度為664 bp。GAPDH上游：5’?CGGAGT?CAACGGATTTGGTCGTAT?3’；下游：5’?AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC?3’，擴增長度300 bp。反應條件：94℃預變性4 min，94℃變性45 s、53℃退火60 s、72℃延伸60 s，共32個循環，最后72℃7min，產物4℃保存。取PCR產物經2%瓊脂糖凝膠（含0.5μg／ml溴化乙錠）電泳，紫外燈下觀察，拍照。計算eNOS與內對照GAPDH條帶灰度比值。

1.2.4 細胞總蛋白提取及Western blot檢測：用RIPA裂解液裂解各組細胞，提取總蛋白，用BCA法檢測各組蛋白濃度，制備8%SDS?PAGE，每泳道加總蛋白量80μg，進行70 V／120 V恒壓電泳，經濕轉印跡到二氟化樹脂（PVDF）膜（Amresco公司），5%BSA?TBST洗滌后加5%牛奶（光明牌脫脂奶粉）?BSA?TBST 37℃封閉1 h，分別加入eNOS兔抗人多克隆抗體（1∶1000稀釋）和GAPDH鼠抗人單克隆抗體（1∶5000稀釋），4℃孵育過夜，5%BSA?TBST洗滌后，GAPDH直接通過ECL化學發光試劑顯影；eNOS再加入HRP標記的山羊抗兔IgG（1∶10 000稀釋），37℃孵育60 min，5%BSA?TBST洗滌，ECL化學發光試劑顯影。eNOS蛋白相對含量用eNOS／GAPDH灰度比值表示。

1.3 統計學處理 應用SPSS 13.0統計軟件對實驗結果進行統計學分析，實驗數據用均數±標準差（s）表示，各組間差異比較采用方差分析，各實驗組間兩兩比較采用q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ET?1對eNOSmRNA和蛋白表達水平的影響 B1組與A1組，B2組與A2組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），10 nmol／LET?1抑制eNOSmRNA和蛋白表達，使eNOSmRNA和蛋白表達水平下調。見表1，2。

2.2 不同濃度IPT對ET?1誘導的eNOSmRNA和蛋白表達水平的影響 C1、D1、E13組eNOSmRNA和蛋白灰度比值均高于B1組（P＜0.05），IPT呈濃度依賴性抑制ET?1誘導的eNOSmRNA和蛋白表達。D2與C2組比較差異無統計學意義（P＞0.05），說明IPT與KATP開放劑PIN作用相同（表2）。在本實驗條件下，IPT 10μmol／L能完全逆轉ET?1 10 nmol／L所誘導的eNOSmRNA和蛋白表達水平下調，使之恢復至ET?1誘導前的水平。見表1，2。

2.3 GLI對IPT的影響 在本實驗條件下，eNOS mRNA和蛋白灰度比值，E2組與C2組、F組與D2組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），E2組、F組與B2組比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。可見特異性KATP阻斷劑GLI可拮抗IPT和PIN對ET?1誘導的eNOSmRNA和蛋白表達水平的影響。見表2。

表1 IPT對ET?I誘導的eNOS mRNA和蛋白表達的影響（s，n＝3）

注：與A1組比較，?P＜0.05；與B1組比較，△P＜0.05

組別eNOS mRNA蛋白A1組0.412±0.016 0.462±0.017 B1組0.105±0.006?0.085±0.004?C1組0.165±0.010?△0.156±0.008?△D1組0.244±0.012?△0.253±0.012?△E1組0.408±0.018△0.454±0.016△

表2 GLI拮抗IPT對eNOSmkNA和蛋白表達的影響（s，n＝3）

表2 GLI拮抗IPT對eNOSmkNA和蛋白表達的影響（s，n＝3）

注：與A2組比較，?P＜0.05；與B2組比較，△P＜0.05

組別eNOS mRNA蛋白A2組0.420±0.016 0.470±0.019 B2組0.114±0.004?0.102±0.002?C2組0.410±0.018△0.480±0.020△D2組0.414±0.014△0.476±0.018△E2組0.106±0.002?0.112±0.003?F組0.110±0.003?0.113±0.004?

3 討論

目前認為，在肺動脈血流剪切力、缺氧等因素作用下，肺血管平滑肌細胞增殖遷移、細胞外基質（ECM）成分改變、結締組織不斷沉積導致肺血管痙攣、異常生長和重構，最終形成PAH［4］。

NO具有較強的舒張血管和抑制血管平滑肌細胞增殖的作用，內源性NO在血管內皮細胞內經唯一的、關鍵的限速酶NOS催化L?精氨酸而生成。在哺乳動物，NOS有3種亞型即NOS1、NOS2、NOS3，它們分別是不同基因的產物，且有50%～60%的序列同源性［5］。NOS3又稱eNOS，為鈣依賴性NOS，分子量約為140 kDa，主要表達于血管內皮細胞，通常與膜蛋白相結合以維持血管活性。長期低氧可抑制eNOS基因和蛋白的表達，導致eNOS含量降低，從而使內源性NO的合成和釋放減少，促進HPH的發生和發展［6?8］。另外，動物實驗表明，NO可通過調節TIMP?1（基質金屬蛋白酶?1）／MMP?1（基質金屬蛋白酶組織抑制因子?1）平衡而減少膠原堆積和增加膠原降解來調節高血流所致的肺血管重構［9］。

雖然目前對PAH的發病機制尚未完全闡明，但一致認為ET系統在PAH的發生發展中發揮了重要作用［10?11］。ET有4種異構體：ET?1、ET?2、ET?3及血管活性腸收縮肽（VIC）［12］。其中ET?1由21個氨基酸殘基組成，是目前已知作用最強、持續最久的縮血管活性多肽。并且ET?1還能促進肺動脈平滑肌細胞遷移和增殖，導致肺血管重構［13?15］。目前ET受體拮抗劑如波生坦已廣泛應用于臨床，但其價格昂貴，且對ET受體具有非選擇性，從而限制了其在臨床上的應用。

本研究表明ET?1濃度為10 nmol／L時可使eNOS mRNA和蛋白的表達水平下調，從而使內源性NO的合成和釋放量減少，促進HPH的發生和發展；新型KATP開放劑IPT呈濃度依賴性地拮抗ET?1 10 nmol／L對原代培養HPAECs eNOSmRNA和蛋白表達水平的影響，濃度為10μmol／L時最為明顯，并使之恢復到ET?1 10 nmol／L誘導前的水平，從而可改善內皮細胞功能障礙，增加eNOS的表達和NO的釋放，逆轉HPH；特異性KATP阻斷劑GLI濃度為10μmol／L時可完全逆轉10μmol／L IPT的作用。

IPT是我國學者自行設計與合成的脂肪仲胺類KATP開放劑，為一新型KATP開放劑，此前發現IPT呈濃度依賴性地抑制HPAECs合成分泌ET［11］、抑制ET?1誘導的人肺動脈平滑肌細胞外信號調節激酶1和2（ERK1／2）磷酸化［16］、抑制ET?1誘導的肺動脈平滑肌細胞增殖［17］，并且其靶向性較其他KATP開放劑高、不良反應少，有可能成為較有前途的治療PAH的新型化合物。

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Effects of ip takalim on them RNA and protein expression level of eNOS in p rimary cultured human pulmonary ar?terial endothelial cells induced by ET?1

MEIHong?bo，YAN Xing．DepartmentofRespitory Medicine，the 82nd Hospital of Chinese PLA，Huaian 223001，China；ZUO Xiang?rong．ICU，the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China

ObjectiveTo study the effects of iptakalim，a novel ATP?sensitive potassium channel opener，on the mRNA and protein expression level of eNOS in primary cultured human pulmonary arterial endothelial cells（HPAECs）in?duced by endothelin?1（ET?1）.MethodsBy Western?blot analysis，the protein expression level of eNOSwasmeasured in primary cultured HPAECs.By RT?PCR analysis，themRNA expression level of eNOSwasmeasured in primary cultured HPAECs.The control group received no intervention，and the other groups were incubated with ET?1，ET?1＋iptakalim，pinacidil or glibenclamide.ResultsThe results demonstrated that ET?1 downregulated themRNA and protein expression level of eNOS.Iptakalim inhibited ET?1?induced downregulation of the mRNA and protein expression level of eNOS in a concentration?dependentmanner.Glibenclamide，a selective KATPchannel antagonist，could antagonize the effects of iptakalim.ConclusionsPulmonary vascular endothelial dysfunction is induced by chronic hypoxia，and the level of NO，themRNA and protein expression of eNOS are decreased.Iptakalim can improve the vascular endothelial dysfunction，in?crease the expression of eNOS and the level of NO，decrease pulmonary artery pressure and will be a most promising new compound to treat pulmonary arterial hypertension.

iptakalim；endothelin?1；KATPchannel；human pulmonary arterial endothelial cells

R 917

A

10.3969／j.issn.1003?9198.2014.07.020

2013?10?30）

223001江蘇省淮安市，中國人民解放軍第八二醫院呼吸內科（梅宏波，嚴星）；210029江蘇省南京市，南京醫科大學第一附屬醫院ICU（左祥榮）