多功能陽離子脂質體跨血脊髓屏障的實驗研究

高仕杰 劉 洋

（天津醫科大學總醫院骨科，天津 300052）

多功能陽離子脂質體跨血脊髓屏障的實驗研究

高仕杰 劉 洋

（天津醫科大學總醫院骨科，天津 300052）

目的探討異硫氰酸熒光素（FITC）標記陽離子脂質體通過尾靜脈注入后，跨越大鼠血脊髓屏障并在局部聚集的情況。方法30只成年Wistar大鼠隨機等分為3組，每組10只，熒光顯微鏡動態觀察脂質體在中樞神經系統（CNS）中靶向聚集與擴散情況，通過組織學觀測進一步分析其與CNS細胞的關系。結果相同濃度下（75～600 μg/mL），TAT-PEG-陽離子脂質體較未經TAT修飾者具更低細胞毒性，且更易被MCF-7細胞攝??；FITC標記TAT-PEG-陽離子脂質體可跨越BSCB并聚集，低倍鏡下觀察到許多熒光微粒聚集于CNS組織，高倍鏡形象地顯示出熒光微粒位于神經細胞內。結論經跨膜肽（TAT）、聚乙二醇（PEG）修飾的陽離子脂質體具有良好的生物相容性與靶向定位特性，可跨過BSCB，聚集于CNS細胞中，安全用作藥物載體，為中樞神經系統疾病的治療提供新的途徑。

陽離子脂質體；異硫氰酸熒光素；血脊髓屏障

目前，中樞神經系統（central nervous system，CNS）疾病的治療仍為醫學界面臨的一大難題，藥物依然是治療此類疾病最為可靠的方法[1-2]。然而，由于血脊髓與血腦屏障中內皮細胞緊密連接的存在，大分子藥物很難通過，限制了其發揮有效作用。許多研究探討過解決此問題的方法[3-8]，但無一結果令人滿意。因此，我們需要尋找一類更為有效的藥物運載方式。脂質體作為一種納米載體，能夠擴散至內皮細胞膜內，并依靠被動運輸進入中樞神經系統。而單純脂質體水溶性低，需要對其進行進一步修飾。

研究表明，表面連接TAT可增強脂質體跨越血腦屏障的能力。有學者已證明了經TAT修飾的微粒能夠攜帶抗生素經過血腦屏障以治療急性細菌性腦炎[9-10]。本實驗使用FITC標記制備的TAT-PEG-陽離子脂質體，使其兼具跨膜、長循環及熒光示蹤功能，經尾靜脈將其注入大鼠體內，旨在分析此新型脂質體跨越血脊髓、血腦屏障的能力，為中樞神經系統疾病的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：健康成年雄性Wistar大鼠30只（8周齡），體質量（220±10）g，中國醫學科學院放射醫學研究所提供。

1.1.2 主要儀器：眼科手術器械（新華手術器械廠），熒光顯微鏡（OLYMPUS BX-60，Japan），透射電子顯微鏡（JEOL-100CXII，日本電子光學公司），激光粒度分析儀及zeta電位分析儀（Malvern Instruments Ltd.，U.K.），電子天平（JA-2003，上海），切片機（LEUCER，USA）。

1.1.3 主要試劑：PEG-陽離子脂質體、TAT-PEG-陽離子脂質體、FITCTAT-PEG-陽離子脂質體（天津大學材料學院納米生物技術研究所），高糖DMEM培養液（Solarbio公司，天津鼎國生物技術有限責任公司代理）、胎牛血清（GIBCO公司，USA）：將上述兩種試劑按9∶1配制成含10%FBS的DMEM培養液作為培養基供MCF-7細胞培養用，MTT（四甲基偶氮唑鹽）（Genview公司）：用0.01 mol/L PBS（pH 7.0）配成5 mg/mL，4 ℃避光保存，二甲基亞砜（天津市化學試劑三廠，分析純）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物飼養：于溫度20～23 ℃，濕度50%～70%，照度200勒克斯（12-h light and 12-h dark cycle），噪音60分貝，通風條件（10～15次/小時）下飼養動物，自由進食水。

1.2.2 細胞培養：MCF-7人乳腺癌細胞（南開大學生命科學學院提供）在含12%新生小牛血清的RPMI-1640培養基中培養，置于37 ℃、95%濕度、5%CO2培養箱中。每1～2 d換液1次，每2～3 d傳代1次，取對數生長期的細胞用于實驗。

1.2.3 FITC -TAT-PEG-陽離子脂質體的測定：通過透射電子顯微鏡觀察FITC-TAT-PEG-陽離子脂質體的形態學特征；平均粒徑、粒徑分布與zeta電位通過激光粒度分析儀及zeta電位分析儀進行分析。

1.2.4 脂質體體外毒性試驗：胰酶消化對數期MCF-7細胞，終止后離心收集，制成細胞懸液，調整其濃度至（5～10）×104/mL。接種于96孔板，1次加6孔，每孔100 μL（邊緣孔用無菌PBS填充）。將接種好的細胞培養板放入培養箱中，5%CO2、37 ℃孵育，貼壁生長約24 h，至細胞單層鋪滿孔底。加入不同濃度梯度藥物，每孔100 μL，每個梯度設6個復孔。5%CO2、37 ℃孵育4、12、24、48 h。而后每孔加入20 μLMTT溶液（5 mg/mL，即0.5%MTT），5%CO2、37 ℃孵育培養4 h，濾紙吸去上清，溶解結晶。無菌0.01 mol/L PBS洗1～2次。每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min。在酶聯免疫檢測儀OD570 nm處測量各孔的吸光值，用620 nm作參考波長。計算各濃度細胞存活率，公式如下：細胞存活率%=（實驗孔OD值-調零孔OD值）/（對照孔OD值-調零孔OD值）×100%。

1.2.5 細胞攝取脂質體情況分析：將MCF-7細胞接種于6孔板上（密度1 ×104/孔）。一天后，分別加入FITC-TAT-PEG-陽離子脂質體、FITCPEG-陽離子脂質體及FIFC懸液。于5 s，10 s，4 min，30 min，1 h，24 h后，分別移去介質，PBS液（0.01mol/L）漂洗2次，每次5 s。而后使用熒光封固劑將蓋玻片固定于清潔載玻片上，使用熒光顯微鏡觀察細胞。同時，將細胞置于PBS液中（20 μg/mL）進行PI染色以觀察細胞核形態。

1.2.6 CNS攝取脂質體的體內分析：將30只成年Wistar大鼠隨機等分為3組：單純FIFC懸液對照組（A組）、FITC-PEG-陽離子脂質體組（B組）、FITC-TAT-PEG-陽離子脂質體組（C組），每組10只，均通過尾靜脈將溶液注射于大鼠體內，劑量為4.55 mg/kg。注射后第1、4、8、12及24 h，分別以10%水合氯醛腹腔注射處死大鼠，快速取出其腦與脊髓組織存于液氮中。隨后，將組織置于-80 ℃條件下24 h，而后置于-20 ℃環境中。制作大腦與脊髓前后軸的冠狀位冰凍切片（厚度10 mm），使用包含DAPI的熒光封固劑將其固定于玻片上以進行細胞核染色。使用熒光顯微鏡觀察標本。

1.2.7 組織學分析：制作中樞神經系統組織冰凍切片（厚度30 mm），PBS液漂洗，使用包含PI的熒光封固劑將其固定于玻片上以進行細胞核染色。同時，制作厚度為5 mm冰凍切片進行HE染色。使用熒光顯微鏡與光學顯微鏡觀察標本。

1.2.8 統計學分析：實驗數據以（χ-±s）的形式表示，采用SPSS 13.0統計軟件（SPSS公司，美國）進行統計學分析。P＜0.05被認為具有統計學意義。

2 結 果

2.1 脂質體平均粒徑、粒徑分布與zeta電位值：利用反相蒸發法制備的FITC-TAT-PEG-陽離子脂質體見圖1～3?？梢婈栯x子脂質體分散性較好，呈球形，粒徑多在100 nm以下。粒度分析儀測得的平均粒徑為85.9 nm，粒徑分布范圍在80～100 nm，粒徑分布指數為0.179（圖4a）。zeta電位值為（29.57±3.47）mV（圖4b）。

2.2 細胞毒性比較：MCF-7細胞與不同濃度的脂質體共培養4、12、24、48 h后，生存率見圖5、表1。與600 μg/mL濃度的TAT-PEG-脂質體共培養48 h后，細胞存活率為（61.84±3.34）%，而與PEG-脂質體共培養細胞存活率<50%。細胞存活率隨脂質體濃度的增加而逐漸降低。

2.3 細胞攝取脂質體情況：MCF-7細胞與FITC-TAT-PEG-脂質體共培養一段時間后，可在胞內觀察到密集熒光。TAT-PEG-脂質體跨膜典型的時間依賴性見圖6、7。5 s后，FITC-TAT-PEG-脂質體組、FITC-PEG-脂質體組中細胞膜周圍出現熒光。10 s后，熒光更為明顯，然而，大部分仍位于細胞膜外而未進入胞內。3＇30＂后FITC-TAT-PEG-脂質體組的胞膜與胞質中均可觀測到熒光。4 min后，熒光出現于細胞內，但仍位于細胞核外。1 h后（1～24 h）熒光均位于細胞內，兩組分布無差別。

2.4 CNS中脂質體聚集情況：于尾靜脈注射4 h后發現，較脊髓與腦組織中其他區域，熒光更多集中于毛細血管，表明脂質體由毛細血管進入周圍組織（圖9a1、b1）。此外，由于灰質血供豐富，脂質體主要聚集于此，白質中幾乎沒有出現（圖9c1、d1）。低倍鏡下可觀察到許多熒光微粒聚集于CNS組織；高倍鏡亦可形象顯示出熒光微粒位于神經細胞內（圖8，白色箭頭）。通過比較HE與熒光染色，可知CNS中熒光微粒與細胞的關系（圖9），相同結果亦在注射1 h與24 h后觀察到，這很大程度上取決于PEG的長時間循環特性。

圖1 反向蒸發法制備脂質體流程圖

圖2 FIFC-TAT-PEG-陽離子脂質體結構示意圖

圖3 FIFC-TAT-PEG-陽離子脂質體透射電鏡圖，可見該脂質體呈球形，粒徑分布較均勻，脂質體粒徑＜100 nm

圖4 FIFC-TAT-PEG-陽離子脂質體粒徑分布及zeta電位值，有效粒徑大小約為85.9 nm（a），平均電位在（29.57± 3.47）mV，具有較好的分散性及穩定性

圖5 與脂質體共培養的MCF-7細胞生存率，圖a示與非TAT修飾脂質體共培養4、12、24、48 h后MCF-7細胞體外生存率；圖b示與TAT修飾脂質體共培養4、12、24、48 h后MCF-7細胞體外生存率

圖6 熒光顯微鏡下觀察MCF-7細胞與FITC-TAT-PEG-陽離子脂質體、FITC-PEG-陽離子脂質體、單純FITC共培養情況分別如圖a、b、c所示

圖7 37 ℃下，與FITC-TAT-PEG-陽離子脂質體共培養24 h，高倍鏡觀察MCF-7細胞如圖所示，細胞核經PI染色，圖a為FITC熒光細胞顯像，圖b為PI染色后細胞核顯像，圖c為a、b重疊像

圖8 大鼠尾靜脈注射FITC-TAT-PEG-陽離子脂質體4 h后，脊髓與腦組織冰凍切片經熒光顯微鏡（a）、亮場顯微鏡（b）觀察結果如圖所示,c為a、b重疊像，箭頭示熒光微粒聚集于脊髓和腦組織神經細胞中

3 討 論

脂質體與帶負電荷的細胞膜產生靜電作用而導致細胞毒性，這與其數量、濃度、陽離子分布相關。聚合物相對分子質量和電荷密度的增加會造成細胞膜的損傷，甚至細胞死亡。本實驗用MTT法檢測MCF-7細胞與脂質體共培養后的存活率，該法簡便、快速，且能較客觀地反映細胞相對存活情況，在細胞毒性實驗中應用廣泛。結果顯示，與低密度TAT-PEG-陽離子脂質體共培養的細胞具有較高生存率，表明新型脂質體具有良好的生物相容性，在相對安全劑量范圍內（75 μg/mL）并不影響細胞存活率，故新型脂質體可安全用作藥物載體。分析其原因，主要是因為TAT修飾的脂質體以更多數量迅速進入MCF-7細胞內，減少了帶正電荷的脂質體在細胞外的蓄積。未經TAT修飾的脂質體只有較少量進入細胞內，造成過多正電荷在胞外蓄積。

表1 與不同濃度脂質體體外共培養不同時間后MCF-7細胞生存率（n=10）

圖9 大鼠尾靜脈注射FITC-TAT-PEG-陽離子脂質體4 h后，高倍鏡觀察CNS神經細胞中熒光微粒分布如圖所示，細胞核經DAPI染色

最近研究表明[11-13]，TAT通過巨胞飲，一種內吞形式完成內化過程，為此類多肽的研究提供了新的依據。TAT介導的內化過程主要包含三個步驟：首先為依靠細胞表面廣泛存在的多糖鏈與胞體表面結合；而后TAT可能通過結合細胞表面蛋白或蛋白聚糖、糖脂途徑激活巨胞飲作用[14]，與細胞表面陰離子多聚糖鏈，如硫酸肝素結合，在內化過程中起著關鍵作用，這種結合可促進其進入巨胞飲體；最后從巨胞飲體中脫出進入胞質，這很大程度上依賴于胞內PH值，TAT干擾了膜的穩定性，從而進入細胞質中。

FITC是一種常用的綠色熒光探針，是目前應用最廣泛的熒光素。本實驗用FITC標記TAT-PEG-陽離子脂質體，可清晰顯示其在MCF-7細胞內外的情況。實驗結果表明FITC-TAT-PEG-陽離子脂質體較未經TAT修飾者能夠更快、更有效地進入MCF-7細胞中。由此可知，TAT具有促進細胞攝入脂質體的功能，FITC-TAT-PEG-陽離子脂質體可以有效結合于MCF-7細胞表面并進入胞內。而且細胞熒光顯像發現，TAT介導的陽離子脂質體不僅進入細胞質，而且進入細胞核，這就為基因轉染提供了較多可能性。

實驗中，在尾靜脈注射脂質體后1～24 h區間內，實驗組可在CNS神經細胞內及其周圍觀測到熒光，這說明FITC-TAT-PEG-陽離子脂質體不僅能跨過血脊髓屏障與血腦屏障，而且能夠穿越細胞之間的組織到達臨近細胞，這與我們之前所做FITC-TAT-PEG-陽離子脂質體與MCF-7細胞共培養的實驗結果相一致。實驗也證明未經TAT修飾的脂質體跨CNS屏障能力有限，單純FITC不能跨過血脊髓、血腦屏障。原始脂質體依被動擴散跨血脊髓、血腦屏障，此機制受CNS損傷處的多種條件限制，如pH值、顆粒直徑、相對分子質量等。將PEG包繞于脂質體表面，可減少血漿蛋白的黏附作用，避免單核巨噬細胞對脂質體的快速識別[15]，減少RES攝入，延長其循環時間。作為跨膜肽，TAT能夠誘導內吞泡的形成，并通過類似AMT機制引起質膜的內吞作用。實驗證實，將PEG、TAT與脂質體相結合，能夠使其最大程度地跨越血脊髓、血腦屏障并聚集于受損局部，以更為有效地發揮所承載藥物的作用，使之有望成為中樞神經系統疾病治療的有力工具。

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Fitc Loaded Tat-Peg-Modified Liposomes Cross the Blood-Spinal Cord and the Blood-Brain Barriers

GAO Shi-jie, LIU Yang
(Department of Orthopaedics, General Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300052, China)

ObjectiveTo observe the ability of fluorescein isothiocyanate(FITC) loaded transactivating-transduction protein(TAT)-polyethylene glycol(PEG)-modified liposomes crossing the blood-spinal cord barrier(BSCB) of rats, then localizing there after injection of caudal veins.MethodThirty rats were divided into three groups. Rats were injected with liposome solution (4.55 mg/kg) via the caudal vein. Using fluorescence microscope and histological methods to analyse.ResultsAt the same concentration(75-600 μg/mL), TAT-modified liposomes had lower cytotoxicity, and were more easily uptaken by MCF-7 cells than the ones without TAT. We observed that TAT-modified liposomes crossed the BSCB, accumulated in CNS tissue and aggregated into cells there by microscope.ConclusionTAT-PEG-modified liposomes have the characteristics of bio-compatibility and targeting. They can cross the BSCB acting as a drug carrier and accumulate in CNS tissue for future CNS disease treatment.

Liposome; Fluorescein isothiocyanate(FITC); Blood-spinal cord barrier(BSCB)

R741.04

B

1671-8194（2014）34-0045-03