GSTP1和RASSF1A在前列腺癌組織中的甲基化檢測及其表達研究

張永旺 武振華 馮少勇 柯鑫文 張雁鋼

前列腺癌（PCa）是老年男性的常見疾病。PCa在歐美地區占男性惡性腫瘤首位，是導致發達國家男性癌死亡的主要原因[1]。我國PCa發病率較歐美低，但近年來，我國PCa的發病率呈現明顯上升趨勢。目前，血清前列腺特異性抗原（PSA）作為PCa的單一檢測指標，雖然具有較高的PCa陽性診斷預測率，但它受到年齡、前列腺按摩、穿刺、感染、藥物等因素的影響，致使其診斷的敏感性、特異性不高，不能充分滿足臨床需要，因此，PCa急需要敏感特異的生物標記物。

腫瘤是多因素參與、多基因變異積累、多階段發生的復雜的病理過程。PCa的發病機制尚未明確，探索PCa的發病機制，將為PCa的早期診斷與治療提供理論依據。DNA甲基化是表觀遺傳學的主要修飾方式之一，在基因表達的調控、基因結構的穩定等方面有重要作用，與腫瘤的發生發展關系密切[2]。進一步研究發現，PCa的臨床分期與DNA甲基化密切相關，甲基化往往發生在腫瘤的早期，且甲基化頻率隨著疾病的進展而增高[3]。通過筆者對國內外PCa的甲基化研究文獻進行檢索，同時參考Ahmed[4]對PCa生物標記基因的預測。筆者預測GSTP1和RASSFIA最有可能成為PCa的早期生物標記，同時也有可能為疾病的預后提供更多提示。本研究旨在采用甲基化特異性聚合酶鏈反應（MSP）方法檢測PCa組織和前列腺增生（BPH）組織中谷胱甘肽-S-轉移酶1（GSTP1）和RAS相關區域家族1（RASSF1）基因啟動子區CpG島甲基化改變；采用免疫組化SP染色法檢測PCa組織和BPH組織中GSTP1和RASSF1的蛋白表達情況，進一步研究GSTP1和RASSF1A基因異常甲基化及靶蛋白的表達情況，探討GSTP1和RASSFIA基因甲基化作為PCa早期診斷的價值及在PCa中的作用。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集山西醫科大學附屬第一臨床醫學院病理科PCa組織石蠟標本及BPH組織石蠟標本，分別進行組織DNA甲基化檢測及免疫組化。其中經前列腺根治手術切除的PCa組織石蠟標本50例，患者年齡為51-82歲，平均（65.72±9.09）歲；BPH組織石蠟標本30例，患者年齡52-83歲，平均（66.13±10.23）歲。所有樣本均經病理學診斷證實，且PCa患者術前均未進行化療或放療治療。

1.2 主要試劑和儀器 OMEGA FFPE DNA Kit（50）；Realtime PCR Master Mix；EpiTect Bisulfite Kits（48）；EpiTect Control DNA（100）；2×NI-Taq PCR MasterMix；鼠抗人GSTP1單克隆抗體、鼠抗人RASSF1A單克隆抗體；全自動酶標儀DG3022A型；PCR儀Applied Biosystems；凝膠成像系統AlphaImager HP。

1.3 方法

1.3.1 MSP方法 根據文獻[5-6]設計引物，具體序列如表1所示，ACTB引物參考文獻；所有引物由Invitrogen公司合成。

PCa組織BPH組織分別進行DNA常規提取。提取的DNA經紫外分光光度計測定A260/A280比值在1.7~20之間的為合格標本，計算標本DNA濃度，按亞硫酸鹽處理試劑盒說明書進行DNA甲基化修飾；取約50 ng亞硫酸處理后DNA作為模板，以NEB公司2×NI-Taq PCR MasterMix作為原料，以ACTB為內參，應用PCR儀器（Applied Biosystems）進行擴增反應。每次反應均設陽性對照，空白對照（雙蒸水為陰性對照），每個樣本重復3次。PCR反應條件為：95 ℃預變性 10 min；95 ℃變性 30 s，53/58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，45個循環；最后72 ℃延伸15 min。然后在3%的瓊脂糖凝膠上電泳，電泳結束后，采用凝膠成像系統成像，分析結果。

表1 GSTP1和RASSF1A基因甲基化與非甲基化引物序列

1.3.2 免疫組織化學方法 PCa和BPH石蠟組織切片經常規脫蠟后，放入3%雙氧水-甲醇溶液中浸泡10 min，以封閉內源性過氧化物酶，經高壓抗原熱修復之后，滴加抗體（詳細步驟按照說明書進行），經DAB顯色，蘇木精復染。每批染色用已知陽性切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。顯微鏡下觀察，結果采用半定量計分法判斷，陽性細胞數打分：陽性細胞數<5%為0分，5%~25%為1分，26%~50%為2分，51%~75%為3分，>75%為4分；染色強度打分：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；再由陽性細胞數及染色強度的乘積判斷陽性等級：0~2分為陰性（-），3~8分為弱陽性（+），9~12分為強陽性（++）。

1.4 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件對所得數據進行統計分析，采用 字2檢驗對GSTP1及RASSF1A基因在PCa與BPH組織中的甲基化率進行比較分析，同時采用相同的方法對靶蛋白的陽性強度進行統計分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MSP法檢測結果比較 采用MSP法對50例PCa組織和30例BPH組織中的GSTP1基因及RASSF1A基因進行甲基化檢測，50例PCa組織中GSTP1基因及RASSF1A基因啟動子區高甲基化例數分別為38例和34例，甲基化率分別為76.00%和68.00%。30例BPH組織中，GSTP1基因及RASSF1A基因啟動子區高甲基化例數分別為1例和5例，甲基化率分別為3.33%和16.67%，見表2。結果顯示，PCa組織中GSTP1基因及RASSF1A基因啟動子甲基化頻率均明顯高于BPH組織，差異均有統計學意義（P<0.001）。

表2 PCa組織和BPH組織中GSTP1和RASSF1A基因的甲基化檢測結果比較 例

2.2 免疫組織化學法檢測結果比較 采用SP染色法對50例PCa組織和30例BPH組織中的GSTP1蛋白及RASSF1A蛋白進行檢測，50例PCa組織中GSTP1蛋白及RASSF1A蛋白陽性反應的例數分別為10例和19例，陽性率分別為20.00%和38.00%。30例BPH組織中GSTP1蛋白及RASSF1A蛋白陽性反應的例數分別為23例和27例，陽性率分別為76.67%和90.00%，見表3。結果顯示，GSTP1蛋白及RASSF1A蛋白在PCa組織中的表達均明顯低于BPH組，差異均有統計學意義（P<0.001）。

表3 GSTP1和RASSF1A基因在PCa組織和BPH組織中的表達比較 例

3 討論

DNA甲基化是一種調節基因表達的表觀遺傳學機制，它通過甲基化使抑癌基因和相關保護基因沉默，致使靶蛋白表達缺失，促進了PCa的發生、發展。本研究通過對GSTP1和RASSF1A基因在PCa組織中的甲基化檢測及其靶蛋白表達研究，分析探討GSTP1和RASSF1A基因甲基化在PCa的發生發展過程中的作用。GSTP1基因定位于染色體11q13，GSTP1參與代謝、解毒和消除潛在的具有基因毒性的外來復合物，它能夠代謝多種致癌化合物，起到保護細胞避免DNA損傷和癌細胞形成的作用，抑制GSTP1活性可以導致DNA損傷的敏感性增強和癌變發生的幾率增加。筆者對GSTP1基因啟動子區甲基化檢測顯示：PCa與BPH相比，GSTP1甲基化頻率較高；這說明GSTP1在正常前列腺組織中以非甲基化形式存在，在PCa中多以高甲基化形式存在。結合免疫組化結果：GSTP1在正常前列腺上皮多呈現強陽性或陽性反應，而在PCa惡性上皮多呈陰性反應。結合以上研究，說明在BPH組織中GSTP1高表達而在PCa組織細胞中存在GSTP1低表達或表達缺失。研究提示在PCa中GSTP1啟動子區高甲基化導致了靶蛋白表達降低甚至缺失，促進PCa的發生發展。

RASSF1A是Dammann等[6]與2000年發現的一種新型的抑癌基因，該基因的表達失活在人類多重腫瘤的發生發展中起著重要的作用。然而基因突變、缺失及DNA啟動子區異常甲基化均可能導致RASSF1A基因的失活，人類腫瘤中的RASSF1A表達缺失是一個普遍事件，至少在37種腫瘤中存在RASSF1A啟動子的異常甲基化[7-8]。現已有關于該基因的表達及其甲基化的檢測報道[9-11]。筆者對RASSF1A基因啟動子區甲基化檢測顯示：PCa組織中RASSF1A基因啟動子甲基化率明顯高于BPH，但是BPH中也有部分甲基化的發生。說明RASSF1A在PCa發生進展的過程中，RASSF1A基因的甲基化頻率逐步增高。免疫組化方面：RASSF1A在BPH組織中的表達明顯高于PCa組織，癌組織RASSF1A蛋白表達明顯降低或缺失。結合上述兩種方法，筆者認為RASSF1A基因啟動子高甲基化可能造成該基因表達降低或失活，導致靶蛋白表達減少或缺失。這樣的結果提示，RASSF1A基因可作為PCa早期診斷的分子標記物，同時為PCa的臨床分期提供依據。

通過對GSTP1和RASSF1A基因的研究，筆者發現DNA啟動子區CpG島甲基化的發生致使蛋白低表達進而導致PCa的發生和進展。本研究中GSTP1基因的研究結果與國外Ellinger[12]報道結果基本一致，而與國內張彥等[13]研究結果不盡相同，這種差異的存在可能與樣本量、實驗方法或地域不同等因素有關，也有可能為樣本有PCa和BPH組織并存、混雜等因素，因此檢測GSTP1和RASSF1A基因甲基化作為PCa早期診斷的分子標記物，仍需進一步的擴大樣本含量、改變實驗方法或擴大研究范圍來研究證實。

目前，在其他腫瘤中，遺傳學和表觀遺傳學的改變已經應用于臨床。PCa也需要新的檢測和治療方法。以上結果表明，在PCa的發生和發展中，GSTP1和RASSF1A最有可能成為PCa的早期生物標記，同時也將為PCa的診斷、治療、預后提供重要價值。

[1]Jemal A，Ward E，Hao Y，et al.Trends in the leading causes of death in the United States，1970-2002[J].Jama，2005，294（10）：1255-1259.

[2]Esteller M.DNA methylation and cancer therapy：new developments and expectations[J].Curr Opin Oncol，2005，17（1）：55-60.

[3]Perry A S，Foley R，Woodson K，et al.The emerging roles of DNA methylation in the clinical management of prostate cancer[J].Endocrine Related Cancer，2006，13（2）：357-377.

[4]Ahmed H.Promoter methylation in prostate cancer and its application for the early detection of prostate cancer using serum and urine samples[J].Biomark Cancer，2010，125（2）：17.

[5]Z?chbauer-Müller S，Fong K M，Virmani A K，et al.Aberrant promoter methylation of multiple genes in non-small cell lung cancers[J].Cancer Research，2001，61（1）：249-255.

[6]Dammann R，Li C，Yoon J H，et al.Epigenetic inactivation of a RAS association domain family protein from the lung tumour suppressor locus 3p21.3[J].Nat Genet，2000，25（3）：315-319.

[7]Dammann R，Schagdarsurengin U，Seidel C，et al.The tumor suppressor RASSF1A in human carcinogenesis：an update[J].Histol Histopathol，2005，20（2）：645-663.

[8]Hesson L B，Cooper W N，Latif F.The role of RASSF1A methylation in cancer[J].Dis Markers，2007，23（1-2）：73-87.

[9]高云霞，關明，張萬忠，等.膠質瘤患者RASSF1A基因轉錄表達和啟動子區甲基化的研究[J].中華檢驗醫學雜志，2004，27（7）：427-430.

[10]邵康，赫捷，程邦昌，等.RASSF1基因不同轉錄本在肺癌組織中的轉錄表達及臨床意義[J].中華腫瘤雜志，2003，25（2）：149-152.

[11]張家浩，姜昊文，顧靜文，等.RASSF1A基因在前列腺癌中甲基化檢測及其表達[J].上海醫學，2005，28（5）：366-369.

[12]Ellinger J，Bastian P J，Jurgan T，et al.CpG island hypermethylation at multiple gene sites in diagnosis and prognosis of prostate cancer[J].Urology，2008，71（1）：161-167.

[13]張彥，趙坡，鐘梅，等.GSTP1基因在前列腺癌組織中的表達及甲基化狀態研究[J].中華腫瘤防治雜志，2007，14（4）：280-283.