禽流感H5N1亞型不同株抗原抗體相互檢測相關性試驗

陳海娟 胡瑞鴻 吳 瓊 孫 心

（哈藥集團生物疫苗有限公司，黑龍江哈爾濱 150069）

禽流感H5N1亞型不同株抗原抗體相互檢測相關性試驗

陳海娟 胡瑞鴻 吳 瓊 孫 心

（哈藥集團生物疫苗有限公司，黑龍江哈爾濱 150069）

禽流感病毒（Avian Influenza Virus，AIV）是禽流行性感冒（簡稱禽流感，Avian Influenza，AI）的病原。其中高致病性的H5N1亞型AIV可以造成雞群的大批死亡，對家禽養殖業影響嚴重，并可引起人的感染和死亡。通過接種疫苗能有效地控制禽流感的傳播，在禽流感疫苗免疫效力的評價過程中，監測免疫雞血清抗體是最常用、最可行的方法。

2009年農業部批準重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型，Re-5株）和重組禽流感病毒H5亞型二價滅活疫苗（H5N1，Re-5株+Re-4株）制造，2012年重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型，Re-6株）及重組禽流感病毒H5亞型二價滅活疫苗（H5N1，Re-6株+Re-4株）取代以上兩個產品，2014年，北方出現了新的7.2分支毒株，而禽流感Re-4株疫苗和Re-6株疫苗對這種新型流行株的保護效力并不佳。2014年4月11日，農業部發布“中華人民共和國農業部公告 第2093號”，制定了重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型，Re-7株）和重組禽流感病毒H5亞型二價滅活疫苗（Re-6株+Re-7株）2種獸藥產品制造及檢驗規程，全國將主要以Re-6與Re-7兩種疫苗聯合免疫為新的趨勢。

本試驗分別用不同毒株的禽流感試驗抗原與不同毒株禽流感疫苗免疫雞的血清通過HI試驗相互檢測，對抗體效價進行分析，從而得出不同毒株的相關性。

重組禽流感滅活疫苗；不同株；相關性

1 試驗材料

1.1 試驗抗原

禽流感試驗抗原和陽性血清由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所提供，分別為：

禽流感血凝試驗抗原（H5亞型，Re-4株）2012001批

禽流感血凝試驗陽性血清（H5亞型，Re-4株）201201批

禽流感血凝試驗抗原（H5亞型，Re-5株）2012001批

禽流感血凝試驗陽性血清（H5亞型，Re-5株）201201批

禽流感血凝試驗抗原（H5亞型，Re-6株）2012001批2013003批

禽流感血凝試驗陽性血清（H5亞型，Re-6株）201201批201301批

禽流感血凝試驗抗原（H5亞型，Re-7株）2014001批

禽流感血凝試驗陽性血清（H5亞型，Re-7株）2014001批

1.2 實驗動物

21～28日齡SPF雞，由北京梅里亞家禽有限公司提供SPF種蛋，哈藥集團生物疫苗有限公司自行孵化出雛飼養至日齡。

1.3 試驗疫苗

由哈藥集團生物疫苗有限公司生產，分別為：

重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型，Re-5株）201210～201212批

重組禽流感病毒H5亞型二價滅活疫苗（H5N1，Re-5株+Re-4株） 201220～201222批

重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型，Re-6株）201204～201206批

重組禽流感病毒H5亞型二價滅活疫苗（Re-6 株+Re-4 株）201204～201206批 201432～201434批

重組禽流感病毒H5亞型二價滅活疫苗（Re-6 株+Re-7 株）201401～201403批

2 試驗方法

2.1 不同株相互檢測

分別用Re-6株禽流感血凝試驗抗原檢測Re-5株、Re-5株+Re-4株禽流感免疫雞血清；用Re-5株禽流感血凝試驗抗原檢測Re-6株、Re-6株+Re-4株禽流感免疫雞血清；用Re-7株禽流感血凝試驗抗原檢測Re-6株+Re-4株禽流感免疫雞血清；用Re-4株禽流感血凝試驗抗原檢測Re-6+Re-7株禽流感免疫雞血清

2.2 紅細胞凝集試驗（HA）

將稀釋完的96孔V型微量血凝板，每一稀釋度分別加入25μlPBS，再加入1%雞紅細胞懸液25μl。對照孔是50μlPBS加入25μl1%雞紅細胞懸液。

在微量振蕩器振蕩30s左右，室溫（20～25℃）靜置30～40min，判定結果。

將血凝板傾斜70°且靜置10s左右開始記錄，對照孔紅細胞成明顯的鈕扣狀沉到孔底。凡反應孔底部有紅細胞沉積且沿傾斜面向下呈淚珠狀流淌，呈現與紅細胞對照孔一樣者為完全不凝集孔（—）；反應孔底部有紅細胞沉積且沿傾斜面緩慢向下呈淚珠狀流淌者為不完全凝集孔（+）；反應孔底部有紅細胞沉積但不沿傾斜面流淌者為50%凝集孔（++）；除底部有少許紅細胞外，反應孔其他部位幾乎為完全凝集孔（+++）；反應孔底部無紅細胞，整個反應孔完全凝集者為完全凝集孔（＃）。

2.3 4HAU抗原工作液的配制及檢驗

以2.2標定的抗原完全凝集孔對應的最高稀釋倍數為該抗原的血凝效價，除以4得到4HAU抗原的最終稀釋倍數，再進行4HAU抗原的校對。將配制的4HAU抗原用PBS進行1：2、1：3、1：4、1：5、1：6和1：7稀釋。

取96孔V型微量血凝板，每一稀釋度分別取25μl加入到孔中，加入PBS25μl，再加入1%雞紅細胞懸液25μl。對照為50μlPBS+25μl1%雞紅細胞懸液。

以上試驗做2個平行重復。

在微量振蕩器振蕩30s左右。室溫靜置30～40min，判定結果。

表6 用Re-4株試驗抗原檢測Re-6株+Re-7株血清（201401-201403 Re-6株+Re-7株滅活苗）

如果配制的抗原工作液為4HAU，則1：4稀釋度完全凝集（＃）；如果4HAU高于4個單位，可能1：5或1：6為完全凝集；

表1 用Re-6株試驗抗原檢測Re-5株血清（201210-201212Re-5株滅活苗）

表2 用Re-6株試驗抗原檢測Re-5株+Re-4株血清（201220-201222 Re-5株+Re-4株滅活苗）

表3 用Re-5株試驗抗原檢測Re-6株血清（201204-201206 Re-6株滅活苗）

表4 用Re-5株試驗抗原檢測Re-6株+Re-4血清（201204-201206 Re-6株+Re-4滅活苗）

表5 用Re-7株試驗抗原檢測Re-6株+Re-4株血清（201432-201434 Re-6株+Re-4株滅活苗）

如果較低，則可能1：2或1：3為完全凝集。應根據測定結果適當調整，使抗原工作液確為4HAU。

2.4 血凝抑制試驗（HI）

取96孔V型微量血凝板，第1～11孔加入25μlPBS，第12孔加入50μlPBS。隨后第1孔加25μl血清，反復吹吸3～5次混勻，從第1孔吸取25μl血清加入第2孔，混勻后吸取25μl加入第3孔，如此進行倍比稀釋至第10孔，從第10孔吸取25μl棄去。

分別向第1～11孔加入25μl的4HAU抗原工作液，在微量振蕩器振蕩30s左右。室溫靜置30分鐘。

每孔加入1%雞紅細胞懸液25μl。在微量振蕩器振蕩30s左右。室溫靜置30～40min，判定結果。

3 試驗結果

4 試驗總結

（1）禽流感Re-5株血清中含禽流感Re-6株抗體平均相差4.8

（2）禽流感Re-5株+Re-4株血清中含禽流感Re-6株抗體平均相差4.7

（3）禽流感Re-6株血清中含禽流感Re-5株抗體平均相差2.1

（4）禽流感Re-6株+Re-4株血清中含禽流感Re-5株抗體平均相差2.2

（5）禽流感Re-6株+Re-4株血清中含禽流感Re-7株抗體平均相差5.9

（6）禽流感Re-6株+Re-7株血清中含禽流感Re-4株抗體平均相差1.2

5 結論

試驗結果表明：禽流感Re-6株血清含禽流感Re-5株抗體較高，禽流感Re-7株血清含禽流感Re-4株抗體較高，反之則較低，證明重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型，Re-6株）可替代重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型，Re-5株），重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型，Re-7株）可替代重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型，Re-4株）。