類人膠原蛋白－微孔淀粉的制備及生物學評價

蒙俊樺，王琪凱，范代娣，段志廣，喬存存，王溢萍

(西北大學 化工學院，陜西 西安 710069)

各種突發性事故中人體大出血的現象較為常見，臟器等破裂的隱蔽性滲血更是手術中的難題，醫院對病人的手術過程中快速且有效的止血[1－3]是搶救生命中最關鍵的環節。止血材料的應用極為廣泛，如外科手術、戶外旅行、軍事任務及各種突發性事故造成的出血創傷急救等。其中，新型止血材料的研發對由戰爭原因引起的出血創傷具有重要戰略意義[2]。為了克服目前止血材料止血效果不確切、生物相容性差等缺陷，可快速止血的新型止血材料是現階段該領域研究的熱點。

微孔淀粉，也稱多孔淀粉，因其成本低廉，被視為當今具有研究前景的止血材料。微孔淀粉屬于變性淀粉的一種，它通常按照如下工藝處理:將高純度天然淀粉不經過糊化過程直接利用酸或酶處理以后，在其表面形成孔徑較為均勻的微孔，表面微孔直徑約1 μm，微孔容積約占顆粒體積的50%，具有較大的比表面積，且于適當條件下分散在水等溶劑中亦能保持完整結構，具有優異的吸附性，作為藥物、香料、色素等功能性物質的吸附載體或包埋劑，具有高效、安全、可降解等優點，已經被廣泛應用于各行業。

新型類人膠原蛋白[4－5]為基因工程產品，分子設計思路是將人源型膠原蛋白的mRNA逆轉錄得到cDNA，再通過酶切和修飾后對特定序列進行多次重復，再轉化于工程菌，經高密度發酵、分離、純化等復雜過程而得到的一種水溶性高分子蛋白。類人膠原蛋白由于其優異的促細胞黏附、生長及無病毒隱患而被作為一種新型的生物材料應用于止血領域的研究[6]。

1 材料和方法

1.1 材 料

玉米淀粉(corn starch):國產分析純，購于吉林中糧生化能源銷售有限公司;十二水磷酸氫二鈉:天津市化學試劑六廠 AR;檸檬酸:西安化學試劑廠AR;α-淀粉酶:上海索來寶生物科技有限公司提供，酶活5.0×104U/g;糖化酶:上海索來寶生物科技有限公司，酶活1.0×105U/g;氫氧化鈉:西安富力化學廠AR;實驗SD大鼠、大鼠血少量，均購自第四軍醫大學動物實驗中心;生理鹽水:實驗室自配;類人膠原蛋白－微孔淀粉止血粉:本實驗室自制;普通微孔淀粉:重慶泰威生物工程有限公司。

1.2 儀 器

超低溫冰箱 ULT1386-3-V34，美國 REVCO;真空冷凍干燥機 FREEZONE6，美國LABCONCO;靈敏pH計METTLER TOLEDO;水浴鍋;恒溫加熱攪拌機;TGL-16C臺式離心機:上海醫療器械廠;光學顯微鏡:日本Olympus公司;掃描電子顯微鏡SEM:日立 S-750(日本);恒溫水浴箱:江蘇太倉市實驗設備廠;分光光度計:美國MD公司;AG-245電子天平:瑞士Mettler Tolledo公司;高壓蒸汽滅菌器:日本TOMY XS-500;恒溫鼠兔解剖臺:上海科科醫學模型有限公司Cr-HTT;恒溫培養箱:上海智誠分析儀器制造有限公司 ZGP-2270;超凈工作臺:蘇州凈化設備有限公司;一次性培養皿(Φ100 mm):美國康寧公司;自動移液器(吸管、帶吸頭):Eppendorf;玻璃器皿(250℃干熱除熱原);試管架或孵化反應管:西安化玻站。

1.3 實驗方法

1.3.1 微孔淀粉的制備 稱取一定量玉米淀粉于燒杯中，按比例加入去離子水配制成淀粉漿，再取5%的稀鹽酸100 mL，加入到淀粉漿中，于50℃恒溫水浴鍋中保溫半小時后，加入質量分數為6%的NaOH溶液中和至pH為7.0，移去上清。加去離子水溶解，以3 000 r/min離心10 min，再移去上清。重復操作3次，直至pH基本穩定。

取100 g經酸處理后的玉米淀粉于燒杯中，按比例加入去離子水，調配成40%質量濃度的淀粉漿，攪拌均勻，放入恒溫水浴鍋中保溫30 min。

稱取一定量的糖化酶、α-淀粉酶[7～9](酶配比按照糖化酶100 U/mg，α-淀粉酶50 U/mg為準)。再制備緩沖溶液，稱取1.42 g Na2HPO4溶于50 mL容量瓶中，準確定容，得到0.2 mol/L的溶液;精確稱量1.47 g檸檬酸于50 mL容量瓶中，定容得到0.1 mol/L的溶液。先加Na2HPO4，再加檸檬酸，調整pH。最后加入酶的混合物配制成混合溶液，再次調整pH。

混合淀粉漿與酶體系，放于50℃的恒溫攪拌機上加熱攪拌反應數小時。反應結束后，向混合體系中加入6%的NaOH，調整pH至7.0。轉入離心管中進行離心洗滌處理，并維持pH為7.0左右，重復試驗5次。

將洗滌結束的淀粉[5]于恒溫烘干箱中進行干燥，在55℃下進行烘干48 h后，除去上層糖化酶固體，加入去離子水混合均勻，倒入培養皿中，凍干粉碎。

1.3.2 類人膠原蛋白－微孔淀粉復合材料的制備[2]取出一定量實驗室自制微孔淀粉，在離心管中加去離子水溶解成濃溶液，加入一定量的類人膠原蛋白搖勻[10－11]。在5 000 r/min下離心10 min，取出倒棄上清，平行實驗3次。用0.2%(V/V)戊二醛乙醇溶液交聯微孔淀粉與類人膠原蛋白混合物，交聯溫度為50℃，時間為20 h，結束后要洗滌、離心再凍干。將充分混合的溶液倒至一次性培養皿中，按每分鐘下降0.1℃的速度對蛋白溶液進行程序冷凍;程序冷凍結束后迅速轉移至已經預冷好的凍干機內進行真空冷凍干燥，冷阱溫度約－50℃，干燥36 h后取出。

1.3.3 復合酶解法正交實驗分析[12－13]根據復合酶解單因素實驗結果設計了L9因素水平如表1所示。

表1 復合酶解正交實驗L9(43)因素水平表Tab.1 Composite enzyme solution orthogonal experiments L9(43)factors level table

1.3.4 掃描電鏡(SEM)分析 將淀粉樣品粉碎后，均勻地撒在貼有導電膠的樣品樣品臺上，用掃描電鏡觀察，觀測微孔淀粉的表面形態，由SEM圖片分析軟件得到淀粉的微觀圖。

1.3.5 吸水率的分析 以吸水率考量微孔淀粉的吸附性，吸附性直接影響了微孔淀粉止血效果。精確稱量一定量的樣品，記作M1，室溫下用去離子水攪拌20 min后用真空抽濾機抽濾直至沒有水滴下，精確稱量吸附了水的淀粉的質量，記作M2。按以下公式計算吸水率:

吸水率 =[(M2－M1)/M1]×100%

稱取一定量的類人膠原蛋白－微孔淀粉止血材料，分別加入20℃蒸餾水中，輕微攪拌，約30 min充分吸水后，分別用真空抽濾機抽濾，將水分排凈，稱重，精確至0.001 g，計算各組樣品吸收水分的質量與樣品質量的比值，求平均值后再乘以100%即為吸水率。

1.3.6 實驗大鼠肝臟止血實驗[14－16]將實驗用SD大鼠分為類人膠原蛋白－微孔淀粉組和普通微孔淀粉組，每組5只健康實驗大鼠，均常規飼養，腹腔注射2.0%戊巴比妥鈉溶液對試驗大鼠進行麻醉后固定于恒溫臺上，所用手術器械均濕熱滅菌烘干，手術過程嚴格按照外科手術要求進行操作，備皮處用碘伏消毒后75%酒精脫碘，逐層開腹，待可見肝臟時用海綿鉗墊無菌紗布將肝臟緩慢拉出，用手術刀在肝葉劃大約l.0 cm×1.0 cm的切口，分別將準備好的類人膠原蛋白—微孔淀粉止血材料、普通微孔淀粉止血材料撒上切口并使用無菌紗布敷壓切口，記錄止血時間，觀察兩種微孔淀粉在創面的粘附情況并對手術部位拍照保存。

2 結果與討論

2.1 復合酶解法正交實驗結果

表2給出了復合酶解制得的微孔淀粉的吸水率正交實驗結果和極差分析。

表2 復合酶解正交實驗結果和極差分析Tab.2 Composite enzyme solution orthogonal experimental results and range analysis

由表2可知，4個因素對微孔淀粉吸水率的影響依次為:B＞A＞D＞C，即酶解時間＞酶加入量＞pH值＞反應溫度。而根據極差分析可以得到復合酶的最佳參數為:A2B2C1D1，即酶使用量為理論水解掉40%淀粉的量，酶解時間20小時，酶解溫度50℃，pH為4.8。

2.2 掃描電鏡結果與分析

由圖1分析可得，經處理過后，淀粉表面分布有較多的微孔。從微觀角度上，微孔淀粉堆積密度和顆粒密度低，結構疏松且具有較大的比孔容和比表面積。這使微孔淀粉具備良好的吸附性，表現出分子篩的作用。

圖1 微孔淀粉掃描電鏡(SEM)Fig.1 SEM of Microporous starch

2.3 類人膠原蛋白－微孔淀粉止血材料的吸水率測定結果

經計算，試驗中類人膠原蛋白－微孔淀粉的吸水率如表3所示。

表3 類人膠原蛋白－微孔淀粉止血材料吸水率的測定Tab.3 Human-like collagen-microporous starch hemostatic materials bibulous rate measurement

計算后求得類人膠原蛋白－微孔淀粉的平均吸水率為3 580%。

本工藝制備的微孔淀粉具有良好的吸水率，為獲得較出色的止血效果奠定了物理基礎。能否吸收創面的最初滲血在創面止血中極為關鍵，若不能及時吸收最初滲血，很可能対術區造成大面積污染或必須使用其他止血手段進行二次輔助止血，增大手術難度，所以良好的吸水率反映了材料的預期止血效果，是止血材料性能優劣的重要參考指標，關注該指標是我們在今后制備工藝優化過程的一個重點。

2.4 大白鼠肝臟止血實驗結果

由表4可得，相較于外購來的止血劑，復合材料的止血時間更短而且誤差更小。說明用戊二醛復合類人膠原蛋白與微孔淀粉所制成的產品兼具有兩者的優勢。

表4 二種止血粉對大鼠創面的止血時間Tab.4 Two kinds of styptic powder to stop bleeding time in rats liver

3 結論

1)通過電鏡觀察發現，經酸解、酶解反應處理后，淀粉顆粒成孔明顯，表面孔隙分布密集均勻，經材料吸水率測定顯示材料吸水率有明顯提高，符合制備止血材料所必須達到的條件基礎。

2)通過正交試驗優化后的工藝條件為:α-淀粉酶:糖化酶=1∶3，反應溫度為50℃，反應時間為20小時，pH值為4.8。

3)在實驗大鼠體外肝臟實驗結果顯示，類人膠原蛋白－微孔淀粉止血劑相對于微孔淀粉可以更高效地吸收出血點所滲出的血液，并與材料形成復合物而達到止血效果。

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