基于UPLC-代謝組學技術研究澤瀉結合有氧運動對高脂血癥大鼠的改善作用

苗 華，張 旭

(西北大學體育部，陜西西安 710069)

高脂血癥是指各種原因導致的血漿中膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)和(或)低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)過高和(或)高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)過低的一種全身脂代謝異常[1]。高脂血癥是一種嚴重威脅人類健康的疾病，是心腦血管疾病的重要病理基礎，防治高脂血癥是預防心腦血管疾病的有效措施，因而關于高脂血癥發病機制和抗高脂血癥藥物的研究日益受到重視。代謝組學(Metabonomics或Metabolomics)是研究生物體受到刺激或擾動(如基因修飾、環境變化等)前后代謝產物圖譜及其動態變化的一種技術[2]，可以幫助尋找疾病發展過程或治療性干預的生物標示物[3]。近年來，代謝組學已被廣泛應用于疾病診斷、藥物療效與藥物作用機理、毒理學與安全性評價等研究方面。代謝組學技術在中藥黃連素、銀杏葉提取物、復方血府逐瘀湯等防治高脂血癥的應用取得了一定的進展[4－7]。中藥澤瀉是多年水生或沼生草本植物。澤瀉性寒，味甘、淡，歸腎、膀胱經，具有利水滲濕、泄熱通淋、化濁降脂等功效，可用于小便不利、熱淋澀痛、水腫脹滿等癥，近代藥理證明澤瀉具有利尿、抑制動脈粥樣硬化和抗腎結石的活性，同時還有解痙、保肝、抗炎、降低血壓以及抗高血脂等作用[8]。本研究利用高脂血癥大鼠為對象，基于UPLC-代謝組學技術和預防性給樣法，探討澤瀉提取物聯合有氧運動對實驗性高脂血癥大鼠脂質代謝紊亂的干預作用。

1 實驗對象與方法

1.1 澤瀉提取物(AR)

取3kg澤瀉，粉碎，用稀乙醇加熱回流提取，合并提取液，回收乙醇并濃縮至適量，加在已處理好的大孔吸附樹脂柱上，依次用水及不同濃度的乙醇洗脫，收集相應的洗脫液，回收乙醇，噴霧干燥，或回收乙醇，濃縮成稠膏，真空干燥，粉碎，即得。

1.2 高脂血模型－預防性給樣法

健康雄性SD大鼠40只，隨機分成5組(8只/組)，A組(正常對照組)正常食料喂養;B組(高脂血癥模型組)高脂飼料喂養;C組(高脂血癥+AR組)高脂飼料喂養同時灌胃AR提取物10g生藥/kg·d;D組(高脂血癥+有氧運動組)高脂飼料喂養同時進行無負重游泳訓練;E組(高脂血癥+有氧運動+AR組)高脂飼料喂養同時灌胃AR 10g生藥/kg·d，同時進行無負重游泳訓練。實驗時間為4周。

1.3 生化指標測定

第4周末大鼠經腹主動脈采血，3 000 r/min離心10 min，得上層血清。采用自動生化儀測定TC，TG，HDL-C及LDL-C等指標;采用試劑盒測定血清谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和脂質過氧化產物(MDA)測定。

1.4 代謝組學測定

美國Waters液相色譜儀;美國XevoTM飛行時間質譜;MassLynx V4.1工作站;Acquity UPLC HSS T3 column(2.1 mm ×100 mm，1.8 μm)色譜柱;流動相為0.1%的甲酸乙腈(A)－0.1%的甲酸水溶液(B);梯度洗脫程序:0～0.5 min，1%B;0.5～3.0 min，1% ～30%B;3.0～7.0 min，30%～99%B;7.0 ～8.0 min，99%B;8.0 ～10.0 min，99.0% ～1.0%B;流速為0.45 mL/min;自動進樣器溫度為4℃;進樣量為2 μL。質譜條件:ESI正離子模式;毛細管電壓和錐孔電壓分別為3.5 kV和30 V;干燥氣流速800 L/h;干燥氣溫度450℃。

1.5 統計學分析

所有數據用x±SD表示，兩組間差異比較，采用t檢驗，P＜0.05表示統計學上存在顯著性;P＜0.01存在非常顯著差異。

2 結果

2.1 基于UPLC-代謝組學技術的藥效學評價

為了能夠更加清晰地識別不同時間段藥效學細微變化，通常采用化學計量學的方法，基于UP-LC-代謝組學技術結合主成分分析法(PCA)和偏最小二乘法(PLS-DA)等統計學方法對大批量的血清、尿液等數據進行聚類分析，通過數據分類與特殊離群點的尋找等過程，就可以輕松地發現不同組是否有差別。第4周采用PLS-DA處理不同組間比較的結果，可以觀察到單一AR治療組介于正常組和模型組之間，但更接近與模型組(圖1A);單一有氧運動組幾乎與模型組沒有差別(圖1B);AR結合有氧運動組介于正常對照組和高血脂模型組中間(圖1C)。這些結果說明不僅AR結合有氧運動組對高脂血癥有一定的治療作用，而且二者結合的治療效果優于單一AR組或有氧運動組。

圖1 第4周大鼠高脂血癥模+AR組(A)、高脂血癥模+有氧運動組(B)及高脂血癥模+有氧運動+AR組血清組(C)均值PLS-DA分析Fig.1 PLS-DA analysis of hyperlipidemia serum from AR(A)，aerobic exercise(B)and AR in combination with aerobic exercise(C)groups in the fourth week

2.2 樣品對大鼠血清TC，TG，LDL-C和HDLC的影響

與正常對照組對比，高脂血癥模型組的TC，TG和LDL-C都有較大的升高且存在統計學差異(見表1)。與模型組對比，AR組、有氧運動組和AR結合有氧運動組均能顯著降低TC且存在統計學上的顯著性差異;AR組和AR結合有氧運動組均能顯著降低TG和LDL-C，且存在統計學上的顯著性差異。與正常對照組相比，高脂血癥模型組的HDL-C都有顯著的降低，且存在統計學的顯著性差異;AR組和AR結合有氧運動組均能顯著升高HDL-C，且存在統計學上的顯著性差異，其升高HDL-C的效果以AR結合有氧運動組的效果最為顯著(見表1)。上述實驗結果證明，AR，AR結合有氧運動可有效抑制高脂飲食大鼠血清TC，TG和LDL-C水平的升高，但沒有顯著影響HDL-C水平，聯合作用的效果優于AR單一作用，這些與代謝組學的結果一致。

表1 不同治療組對大鼠血清TC，TG，LDL-C和HDL-C的影響Tab.2 Changes of TC，TG，LDL-C and HDL-C in the different groups

2.3 樣品對大鼠血清 SOD，GSH-Px，CAT和MDA的影響

與對照組相比，高脂模型組的SOD，GSH-Px和CAT的含量降低且存在統計學上的顯著性差異，AR組和AR結合有氧運動組與高脂血癥模型組比升高SOD和GSH-Px的含量存在統計學上的顯著性差異;對于CAT，僅AR結合有氧運動組升高CAT的含量存在統計學上的顯著性差異;有氧運動組有升高SOD，GSH-Px和CAT的含量的趨勢，但沒有統計學上的顯著性差異。模型組的血清MDA含量顯著升高，且存在統計學上的非常顯著性差異，AR組和AR結合有氧運動組與高脂血癥模型組比降低MDA的含量存在統計學上的顯著性差異(見表2)。實驗結果證明AR，AR結合有氧運動可有效抑制高脂飲食大鼠血清SOD，GSH-Px和CAT的含量降低和MDA的含量增加，聯合作用的效果優于AR單一作用，這些與代謝組學的結果一致。

表2 不同治療組對大鼠血清SOD，GSH-Px，CAT和MDA的影響Tab.2 Changes of SOD，GSH-Px，CAT and MDA in the different groups

3 討論

代謝組學是繼基因組學、轉錄組學和蛋白質組學后系統生物學的又一重要分支，代謝組學覆蓋了疾病診斷、藥物作用機制、毒理學、營養學、微生物學、環境科學及植物學等方面。代謝組學的出現為中藥療效評價提供了全新的思路和工具，中藥(尤其是復方)的整體性作用機制和療效在系統代謝組學的研究方法下將可能得到充分的展示和挖掘。病理過程中代謝網絡的某些環節出現紊亂，該過程使生物代謝網絡、使細胞產生的內源性產物的種類、濃度、相對比例發生擾動，這種擾動體現在小分子代謝產物集合輪廓的改變。因此，通過比較正常組與模型組的代謝產物集合輪廓，可以從中得出兩者內源性產物種類、濃度、相對比例是否處于相同范圍，進而推斷造模是否成功;通過比較正常組、模型組和治療組的代謝產物集合輪廓，可以從中得出3者內源性產物變化趨勢，進而推斷藥物對模型的治療是否有效、對模型組的治療程度、治療組與正常組的接近程度等相關的變化。PLS-DA圖顯示高脂飲食大鼠血清代謝紊亂，這與用高脂食物喂養大鼠，大鼠TC，TG等升高，顯示高脂血癥癥狀一致。代謝組學已成為判斷藥理模型和藥物藥效是進展程度的新方法，代謝組學的圖譜反映了不同治療組治療高脂血癥的變化過程和改變的趨勢，代謝組學結果說明不僅AR結合有氧運動組對高脂血癥有一定的治療作用，而且二者結合的治療效果優于單一AR組或有氧運動組。

研究報道了澤瀉提取物對高脂血癥有較好的預防和改善作用[9－12]。澤瀉能明顯降低血清中的TC，TG和LDL-C，升高血清HDL-C水平，明顯抑制主動脈內膜斑塊的生成，預先給藥則顯示有預防作用[9]。澤瀉水提醇沉物具有明顯的降血糖和降血脂作用，并能保護胰島組織免受損傷，澤瀉水提醇沉物降低血糖作用與促進胰島素的釋放有關[10]。另外，澤瀉提取物也有抗血小板凝集、抗血栓形成及增強纖溶酶活性等作用，能從降低血脂、抑制內皮細胞損傷、抗血栓等多方面抑制或減輕動脈粥樣硬化的發生、發展。澤瀉的乙酸乙酯提取物、乙醇浸膏的乙酸乙酯提取物等，對實驗性高膽固醇血癥家兔和大鼠都有降血脂作用。乙酸乙酯提取物和其不溶于醋酸中的殘留部分作用最強。醋酸乙酯提取物每日口服1g/kg，對飼以普通飼料的正常大鼠亦有明顯的降低膽固醇作用。用同位標記法證明。澤瀉醇A有抑制小鼠小腸酯化膽固醇的能力，并可使膽固醇在大鼠小腸內的吸收率降低34%，但不影響亞油酸的吸收[9]。本實驗發現 AR可以降低血清 TG，TC，LDL-C，升高血清HDL-C含量，這與文獻報道結果一致。本研究顯示AR和AR結合有氧運動能增加血清SOD，GSH-Px和CAT含量，同時下調血清MDA含量，AR結合有氧運動比單一的AR或有氧運動更好地改善機體的脂代謝紊亂。藥物與有氧運動的結合可能是治療高脂血癥的一條有效途徑。

4 結論

AR或AR結合有氧運動都可以有效地改善機體的脂代謝紊亂，降低血清中的TC，TG，LDL-C含量。聯合作用的效果優于單一AR或有氧運動作用;AR配合有氧運動改善脂代謝紊亂的機制可能與抑制血脂異常、增加血清 SOD，GSH-Px，CAT，降低血清MDA等物質含量和活性有關。

[1]MYLER R K，RYAN C，DUNLAP R，et al.Dyslipoproteinemias in atherosclerosis，thrombosis and restenosis after coronary angioplasty[J].J Invasive Cardiol，1995，7(2):33-46.

[2]NICHOLSON J K，LINDON J C，HOLMES E.‘Metabonomics’:understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data[J].Xenobiotica，1999，29(11):1181-1189.

[3]GOODACRE R.Metabolomics shows the way to new discoveries[J].Genome Biol，2005，6(11):354.

[4]JIANG Z J，LIU F，ONG E S，et al.Metabolic profile associated with glucose and cholesterol lowering effects of berberine in Sprague-Dawley rats[J].Metabolomics，2012，8(6):1052-1068.

[5]LIU F，GAN P P，WU H，et al.A combination of metabolomics and metallomics studies of urine and serum from hypercholesterolaemic rats after berberine injection[J].Anal Bioanal Chem，2012，403(3):847-856.

[6]ZHANG Q，WANG GJ，A J Y，et al.Application of GC/MS-based metabonomic profiling in studying the lipid-regulating effects ofGinkgo bilobaextract on dietinduced hyperlipidemia in rats[J].Acta Pharmacol Sin，2009，30(12):1674-1687.

[7]SONG X，WANG J，WANG P，et al.1H NMR-based metabolomics approach to evaluate the effect of Xue-Fu-Zhu-Yu decoction on hyperlipidemia rats induced by high-fat diet[J].J Pharm Biomed Anal，2013，78-79:202-210.

[8]禹建春，葉紅梅，林西西.澤瀉的藥理研究概況[J].海峽藥學，2011，23(2):92-93.

[9]徐暉.澤瀉藥理作用研究進展[J].湖南中醫藥雜志，2004，20(3):77-78.

[10]楊新波，黃正明，曹文斌，等.澤瀉醇提取物對高血糖小鼠血液生化指標及胰島素的影響[J].中國臨床康復，2004，8(6):1196-1197.

[11]張春海，毛縝，馬麗，等.澤瀉水提取物、醇提取物對小鼠脂代謝影響的比較[J].徐州師范大學學報(自然科學版)，2005，23(2):68-70.

[12]錢家駿.澤瀉抗動脈粥樣硬化作用系統研究:澤瀉研究的進展[J].北京中醫學院學報，1991，14(2):42-45.