L-[S-11C-甲基]-蛋氨酸的合成及HPLC分析

張曉軍，李云剛，劉 健，張錦明，田嘉禾

(中國人民解放軍總醫院 核醫學科，北京 100853)

18F-FDG是目前臨床應用最廣泛的正電子顯像劑，其在腫瘤診斷、分期和療效評價方面有重要作用，但其存在局限性，如：在腦膠質瘤的應用中，低級別膠質瘤與正常大腦白質對18F-FDG的攝取程度無顯著差異，導致18F-FDG PET顯像對低級別膠質瘤檢出率偏低；18F-FDG為非特異性示蹤劑，除惡性腫瘤外，良性病變如炎癥等也可出現高攝取，造成鑒別診斷的困難；同時由于正常大腦皮質高攝取18F-FDG，很難描繪腦腫瘤的邊界及腫瘤浸潤范圍[1]。11C-MET(L-[S-甲基-11C]蛋氨酸)是應用較多的腫瘤氨基酸代謝正電子顯像劑，反映氨基酸的運轉、吸收和惡性腫瘤細胞的代謝活性等，在腦膠質瘤的良惡性鑒別、分期、界定腫瘤浸潤范圍及療效評價等方面有重要的臨床價值[2-4]。11C-MET主要有液相合成法[5]和固相合成法[6]，液相合成法是11CH3I直接與L-高胱氨酸硫內酯在丙酮中反應，并經HPLC分離純化，該法制備時間長，放化產率較低，但11C-MET放化純度高；固相合成法是將溶解于NaOH和乙醇混合液中的L-高胱氨酸硫內酯置于Sep Pak Plus C18小柱，11CH3I通過該柱進行烷基化，該法操作簡便，但11C-MET產品放化純度較低，存在大量放射性雜質。本研究利用國產碳多功能模塊，采用固相合成法，通過改變合成條件，利用HPLC分析放射性雜質的成分，探討不同合成條件對11C-MET合成的影響。

1 實驗材料

HM-20 回旋加速器：日本住友重機械株式會社； PET-CM-3H-IT-Ⅰ碳多功能合成模塊：派特(北京)科技公司；分析型HPLC系統，配Bioscan Flow Count放射性檢測器和2487紫外探測器，Sep-Pak C18分析柱：美國Waters公司；1mol/L的氫化鋰鋁四氫呋喃溶液：美國Sigma公司；57%HI(AR)：比利時Acros公司；L-高胱氨酸硫內酯(AR)：美國RBI公司；無水乙醇(USP級)：美國Milennium公司；NaOH(AR)：北京化學試劑公司；NaH2PO4·2H2O(AR)，H3PO4： 北京化工廠。

11C-MET淋洗液pH3.0,3 mmol/L NaH2PO4溶液；HPLC流動相pH2.5，10 mmol/L NaH2PO4溶液；不同濃度NaOH溶液均為新鮮配制。

2 實驗方法

2.1 11CH3I的合成

利用14N(p,α)11C核反應，在回旋加速器中生產11CO2(靶氣體為含0.51% O2的氮氧混合氣體)，用N2作為載氣將11CO2傳到碳多功能合成模塊中浸潤于液氮的LOOP環內，傳輸完畢后，緩慢下降液氮罐，利用空氣加熱LOOP環，并開啟氮氣，將11CO2傳至反應管中與LiAlH4反應生成11CH3I，加熱并通入N2除去四氫呋喃。加入57% HI，11CH3I水解為11CH3OH并與HI反應生成11CHI3，加熱并通入N2將11CH3I蒸出。

2.2 11C-MET的合成

稱量2～3 mg L-高胱氨酸硫內酯前體，加入0.2 mL新鮮配制的0.5 mol/L NaOH和無水乙醇溶液(V∶V=1∶1)中，溶解后裝于C18柱，合成系統圖示于圖1。淋洗瓶裝5 mL pH3.0 3 mmol/L NaH2PO4溶液，產品收集瓶前接C18純化柱和無菌濾膜，所有準備工作在11CO2傳輸前完成。如2.1節所述，11CH3I從反應管蒸出，經管線直接通過裝有前體的C18柱，常溫下11CH3I與前體在C18柱上反應生成11C-MET，廢氣排入氣囊。待C18處放射性探頭的計數不再升高時，切換閥門，用3 mmol/L NaH2PO4溶液淋洗反應柱并通過C18純化柱和無菌濾膜，將11C-MET溶液收集于無菌瓶中。

圖1 11C-MET自動化合成系統圖Fig.1 Radiosynthesis of 11C-MET

2.3 11C-MET的分析

用分析型HPLC系統分析11C-MET溶液，將11C-MET與標準品12C-MET共進樣，紫外吸收峰設定為206 nm，流動相為pH2.5，10 mmol/L NaH2PO4溶液，流速為1 mL/min。

2.4 11CH3I和11CH3OH的合成及分析

(1) 在C18柱上僅裝載0.1mL無水乙醇，其余同合成11C-MET，如2.1節所述，將11CH3I從反應管蒸出，直接吸附于C18柱上，最后用淋洗液將其淋洗下，分析條件同11C-MET。

(2)11CO2可與反應管中LiAlH4反應生成復合鹽，加熱并通入N2除去四氫呋喃，將57%HI更換為H2O，加入反應管中復合鹽水解為11CH3OH，由于甲醇沸點僅為64.7 ℃，加熱將其蒸出，直接通入去離子水中吸附。分析條件同11C-MET。

2.5 11C-MET合成條件改變和分析

11CH3I合成如2.1節所述，前體L-高胱氨酸硫內酯用量為2～3 mg。

(1) NaOH濃度的影響。分別用0.1 mL 2 mol/L 和5 mol/L NaOH溶解前體，乙醇用量不變，則裝載于C18柱上的NaOH濃度分別為1 mol/L和2.5 mol/L。其余合成條件如2.2節所述，啟動合成程序，并對產物進行HPLC分析，測量11C-MET及雜質的含量。

(2) 溶劑的影響。先用0.1 mL 1 mol/L NaOH溶解2～3 mg前體L-高胱氨酸硫內酯，然后加入0.1 mL丙酮，混勻后裝載于C18柱，其余合成條件如2.2節所述，啟動合成程序，并對產物進行HPLC分析。

3 結果與討論

3.1 11CH3I的合成

11CH3I是制備11C標記化合物最常用的甲基化試劑，生產方法有兩種，還原自由基碘代法和還原碘化法，還原自由基碘代法合成效率較低，反應需高溫，對系統氣密性要求高，得到的11CH3I比活度較高；還原碘化法因引入了載體而導致11CH3I比活度較低，但操作簡便，易于制備，合成效率高。

國產碳多功能模塊采取11CO2經LiAlH4-HI還原碘化法制備11CH3I，可以自動化制備大部分11C標記化合物。本研究利用碳多功能模塊合成11CH3I，準備過程簡單，合成效率高，11CO2至11CH3I的校正后轉化產率達(70±5)%(EOB)。

3.2 11C-MET的合成

早期常用的合成11C-MET方法是11CH3I與L-高胱氨酸硫內酯的直接反應，用-20℃的丙酮溶劑捕獲11CH3I，70 ℃與前體反應，產品經HPLC分離純化，合成時間約為60 min，合成效率約為10%。 經蒸發純化法[7]、Al2O3/KF固相反應法[8]和C-18柱自動化合成法[6]等的改進，固相合成法已被普遍采用。

11C-MET固相合成法是在常溫下，NaOH將前體L-高胱氨酸硫內酯水解開環，生成的巰基為親核反應位置，無水乙醇吸附11CH3I，提供親核反應的溶劑，收集瓶前的C18純化柱可吸附未反應的11CH3I和脂溶性雜質。本研究中，11C-MET的放化純度較低，僅為(92.2±1.5)%(n=5)，而11C-MET溶液的放化純度與合成的條件密切相關。

3.3 11C-MET的分析

11C-MET溶液經HPLC分析，得到的放射性峰示于圖2，11C-MET的保留時間為6.5 min，此外有兩個放射性雜質，保留時間分別為15.1 min和19.2 min，該產品的放化純度為93.0%。同時進樣的標準品12C-MET的紫外峰為6.2 min，與產品的放射性峰保留時間一致(二者時間差為管線長度所致)。

圖2 11C-MET HPLC分析放射性圖譜Fig.2 11C-MET quality control of radio-chemical purity with HPLC

3.4 11CH3I和11CH3OH的合成及分析

11CH3I和11CH3OH HPLC分析條件與11C-MET分析條件相同，11CH3I放射性分析圖譜示于圖3a，直接用乙醇吸附11CH3I，淋洗后進行分析，11CH3I的保留時間為19.5 min，所得的11CH3I溶液中無其余雜質；11CH3OH示于圖3b，將2.1節自動化合成程序中的HI用H2O替代，反應生成11CH3OH，保留時間為2.7 min，為溶劑峰保留時間?？梢?1C-MET產品保留時間為19.2 min的雜質為11CH3I，產品中無11CH3OH，保留時間為15.1 min的雜質可能為前體水解后羧基與11CH3I反應生成11C-4-巰基丁氨酸甲酯。

3.5 11C-MET合成條件

3.5.1NaOH濃度的影響

不同NaOH濃度對產品及雜質含量的影響列于表1。由表1結果可見，提高NaOH濃度有利于前體L-高胱氨酸硫內酯水解開環，從而利于甲基化反應。但隨著NaOH濃度上升，雜質11C-4-巰基丁氨酸甲酯的含量同樣呈上升趨勢，在NaOH濃度為0.5 mol/L和1 mol/L時，其含量差異沒有統計學意義，但采用2.5 mol/L的NaOH溶解前體時，產品中11C -4-巰基丁氨酸甲酯的含量升高到(7.2±1.2)%，11C-MET放化純度降至(92.1±1.1)%，可見反應中堿濃度過量將促進氨基酸成酯反應并降低產品放化純。因此，使用濃度為1 mol/L的NaOH能使產品放化純度大于95%，而未反應的11CH3I和雜質11C-4-巰基丁氨酸甲酯的含量均較低。

圖3 11CH3I和11CH3OH 的HPLC分析放射性圖譜Fig.3 radiochemical spectrum of 11CH3I and 11CH3OH with HPLC

產品及雜質不同NaOH濃度時的物質含量0.5 mol/L1 mol/L2.5 mol/L11C-MET(92.2±1.5)%(95.7±0.7)%(92.1±1.1)%11C-4-巰基丁氨酸甲酯(3.1±1.4)%(2.2±1.3)%(7.2±1.2)%11CH3I(4.7±1.2)%(2.1±1.0)%(0.5±0.4)%

此外，將前體L-高胱氨酸硫內酯稱量于西林瓶后，NaOH和乙醇的加入順序以及放置時間同樣對前體的開環水解有影響。L-高胱氨酸硫內酯微溶于乙醇，當加入NaOH和乙醇的混合溶液時，由于二者等體積混溶，相當于NaOH的濃度降低一半，前體溶解速度較慢，水解效率也較差。先加入0.1 mL乙醇，前體幾乎不溶解，再加入0.1 mL NaOH后，前體才逐漸溶解，水解效率較差。先加入NaOH，前體立即溶解，放置5～10 min后再加入乙醇并混勻，可提高前體水解時NaOH的濃度。

3.5.2前體溶劑的影響

用0.1 mL丙酮替代0.1 mL乙醇溶解前體L-高胱氨酸硫內酯，11CH3I傳入到C18柱，被丙酮吸附，繼而與水解前體的巰基發生親核反應。根據模塊C18柱處放置的放射性探頭計數可知，隨著11CH3I從反應管被N2載帶至C18柱被丙酮吸附，放射性計數持續上升，隨著11CH3I的傳輸，放射性計數不再增加而進入平臺期，隨后放射性計數呈快速下降趨勢。由于丙酮極易揮發，在11CH3I進入C18柱的同時，丙酮也從柱子上揮發，當11CH3I進入與丙酮的揮發導致放射性增減達到平衡時，放射性計數進入平臺期，隨著丙酮的揮發，C18柱中尚未與前體反應的11CH3I也隨著下降，持續的氮氣流可將C18柱上的丙酮吹干，產品中檢測不到丙酮的存在，也降低了11C-MET中11CH3I雜質的含量，但隨丙酮揮發造成的放射性損失將導致產品產率下降近80%，因此采用丙酮溶解前體雖能提高產品放化純，但嚴重降低了產率。而乙醇溶解前體時C18放射性計數上升之后的平臺期較長，未出現計數急速下降的現象，放射性損失少，使用5 mL淋洗液洗脫產品后，產品中乙醇含量約為1%。綜合考慮，使用乙醇溶解前體優于丙酮。

4 小結

本研究利用國產碳多功能模塊，采用固相法合成了11C-MET，用HPLC進行產品放化純度分析，結果表明，先用0.1 mL 2 mol/L NaOH溶解前體，再加入0.1 mL無水乙醇，混勻后裝載于C18柱，可提高11C-MET合成產率和放化純度。

參考文獻：

[1] Mertens K, Acou M, Van Hauwe J, et al. Validation of18F-FDG PET at conventional and delayed intervals for the discrimination of high-grade from low-grade gliomas: a stereotactic PET and MRI study[J]. Clin Nucl Med, 2013, 38(7): 495-500.

[2] Inoue T. A shifting landscape: What will be next FDG in PET oncology[J]. Ann Nucl Med, 2002, 16: 1-9.

[3] Tomura N, Ito Y, Matsuoka H, et al. PET findings of intramedullary tumors of the spinal cord using [18F] FDG and [11C] methionine[J]. AJNR Am J Neuroradiol, 2013, 34(6): 1 278-1 283.

[4] Takenaka S, Asano Y, Shinoda J, et al. Comparison of C-Methionine, C-Choline, and F-Fluorodeoxyglucose-PET for Distinguishing Glioma Recurrence from Radiation Necrosis[J]. Neurol Med Chir (Tokyo), 2014, 54(4): 280-289.

[5] Comar D, Cartron JC, Maziere M, et al. Labelling and metabolism of methionine-methyl-11C[J]. Eur J Nucl Med, 1976, 1:11-14.

[6] Pascali C, Bogni A, Iwata R, et al. high efficiency preparation of L-[S-methyl-11C]methionine by on-column [11C]methylation on C18 Sep-Pak[J]. J Labelled Compd Radiopharm, 1999, 42: 715-724.

[7] Berridge M S, Cassidy E H, Miraldi F, et al. A routine, automated synthesis of11C-MET[J]. Appl Radiat Isot, 1995, 46: 173-175.

[8] Schmitz F, Plenevaux A, Del-Fiore G, et al. Fast chemical synthesis of L-[methyl-11C] methionine[J]. Appl Radiat Isot, 1995, 46: 893-897.