氧化苦參堿對豚鼠心室肌細胞L-型鈣通道電流的影響

黑龍江 張玉瑤 王吉錫 劉洋

前言

苦參出自《本草經百種錄》，是豆科植物苦參Sophora flavescens Ait.的干燥根。其主要成分是苦參堿（matrine）與氧化苦參堿（oxymatrine），在一定條件下，二者還可相互轉化。傳統醫學認為苦參素有清熱利濕、祛風殺蟲、利尿之功。而苦參素中98%以上的成分為氧化苦參堿[1]。大量藥理和臨床研究中發現氧化苦參堿具有抗病毒、抗炎、抗腫瘤作用及對中樞神經系統的鎮靜、鎮痛、解熱、降溫作用，特別是在慢性肝炎和肝纖維化等方面的治療已取得良好療效，且不良反應較少[2]。

氧化苦參堿的心血管藥理研究表明其具有抗心律失常、改善血流動力學和降壓、抗心肌缺血、抗心室重構等作用。大鼠心電圖證明，氧化苦參堿具有明顯的負性頻率和負性傳導作用，可能是其抗心律失常作用的基礎。豚鼠乳頭肌試驗證明它可加強心肌的收縮力，提示其具有改善心功能的作用[3]。苦參總堿能擴張冠狀動脈，增加冠脈血流量，有一過性的降壓作用，能延長小鼠在常壓下的耐缺氧時間[4]。

隨著電生理技術的進步，利用細胞膜片鉗技術研究氧化苦參堿對離子通道電流的作用，可進一步明確其抗心律失常的作用機制。本實驗應用純度98%以上的氧化苦參堿，采用全細胞膜片鉗技術記錄單細胞L型鈣電流，以探討氧化苦參堿起抗心律失常作用的心室肌細胞電生理學機制，為其進一步開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

健康成年豚鼠，雌雄兼用，體重（230±20）g，由黑龍江中醫藥大學GLP中心提供。

1.1.2 藥品與試劑

氧化苦參堿純度大于98%，由中國藥品生物制品檢定所提供；HEPES、EGTA、Na2ATP、小牛血清蛋白（BSA）、膠原酶Ⅱ等購自Sigma公司。

1.1.3 主要儀器

膜片鉗放大器，Axonpatch200B，Axon Instrument，U.S.A；數模轉換器，DigiData 1322A，Axon Instrument，U.S.A；微電極拉制儀，PP830型，Narishige Co.LTD.，Japan；像差倒置顯微鏡，OLYMPUSIX70，Japan；Langendorff灌流裝置，上海。

1.1.4 軟件

記錄程序：Pclamp 9.2，Axon Instrument，California，U.S.A；分析程序：Clampfit8.0，Axon Instrument，California，U.S.A；Sigmaplot5.0.

1.1.5 溶液[5,6]

正常臺氏液（Tyrode’s solution,mmol·L-1）：NaCl 126，KCl5.4，CaCl2 1.8，NaH2PO4 0.33，MgCl2 1.0，HEPES10，Glucose10，用NaOH調pH至7.4。無鈣臺氏液（Calcium-free Tyrode’s solution，mmol·L-1）：除沒有CaCl2之外，其余成分與正常臺氏液相同。細胞保存液（KB solution，mmol·L-1）：Glutamic acid 70，Taurine15，KCl 30，HEPES10，KH2PO410，MgCl20.5，EGTA0.5，Glucose10，用KOH調pH至7.3～7.4。電極液（Pipette solution，mmol·L-1）：KCl20，Potassium Asparate110，HEPES5，MgCl21.0，EGTA 10，Na2ATP 5，用KOH調pH至7.2。

1.2 方法

1.2.1 豚鼠單個心肌細胞的分離[7]

豚鼠撞擊頭部致昏，仰臥位固定，開胸取心臟置于4℃臺氏液中，剝離主動脈連接于Langendorff灌流裝置上，以8m l·min-1流速連續灌流約5min后，無鈣臺氏液灌流至心臟停搏。0.02%膠原酶Ⅱ的無鈣臺氏液灌流消化約20min后，自心房分段剪取心肌組織，吹打使之分散成單個細胞。所有液體均用95%O2+5%CO2飽和，除特殊說明，溫度保持在37±0.5℃。

1.2.2 電生理記錄

應用全細胞膜片鉗記錄[8]單細胞動作電位。

將分離好的單個心肌細胞懸液滴加入浴槽中，待細胞貼壁后，正常臺氏液3ml·min-1恒速沖洗至細胞表面清潔。選擇靜止、桿狀、橫紋清晰、折光性良好的正常心肌細胞進行封接。形成全細胞構型5min后，在電壓鉗模式下記錄膜電流。在正常臺氏液中，加入5mmol·L-1CsCl取代鉀離子，以排除鉀離子干擾。將保持電壓固定于-40mV（排除鈉電流的干擾），實驗電壓從-30mV以10mV為步階躍至+70mV。在不加氧化苦參堿的情況下，記錄各電壓條件下正常的ICa-L。完成后，給予1μmol·L-1的氧化苦參堿，記錄各電壓條件下的ICa-L。記錄結束后，用正常的臺氏液以3m l·min-1沖洗，5min后記錄洗脫后各電壓條件下的ICa-L。

實驗過程由計算機軟件pCLAMP9.2（Axon Instrument）控制數模轉換器完成刺激信號的產生、反饋信號的采集以及數據分析。

1.3 數據分析

本實驗中計量資料以平均數±標準差（±s）方式表示，應用組間t檢驗進行統計學分析，雙尾概率以p<0.01作為顯著性差異標準。分析程序用Clampfit8.0。

2 結果：氧化苦參堿對豚鼠心室肌細胞ICa-L的影響

形成全細胞構型后，在電壓鉗模式下記錄電流。在正常臺氏液中，加入5mmol·L-1CsCl取代鉀離子以排除鉀離子干擾。將保持電壓固定于-40mV（排除鈉電流的干擾），實驗電壓從-30mV以10mV為步階躍至+70mV，測定從0時開始到刺激結束時的300ms電流穩態值。氧化苦參堿1μmol·L-1在各電壓條件下均可增加ICa-L（見圖1）。在實驗電壓+10mV時，氧化苦參堿使ICa-L從給藥前（-8.03±1.90）pA/pF增加至（-9.93±2.95）pA/pF（n=5，p<0.01），沖洗5min后ICa-L恢復至（-8.65±1.38）pA/pF（n=5，p<0.01）參堿對I-V曲線的影響。

圖1 氧化苦參堿對豚鼠心室肌細胞L型鈣通道電流的影響>Fig.1 Effectsofoxymatrineon L-type calcium currentof cardiacmyocytes in guinea pigs

（*P<0.01與對照組相比）

3 討論

近年來，關于離子通道研究進展的深入，推動了心律失常診斷和治療。目前，臨床上常用的幾類抗心律失常藥物均存在共同不足，如在治療心律失常時，往往又誘發心律失常、傳導阻滯，其發生率較高。為了彌補西醫抗心律失常藥物治療的不足，采用中醫藥辨證施治或采用中成藥治療心律失常研究日漸增多。離體動物實驗證實，氧化苦參堿不同濃度可明顯增加蟾蜍、家兔和豚鼠心肌收縮力，心輸出量，并不伴有心率的加快[9]。在血流動力學方面，氧化苦參堿可降低前后負荷，糾正心衰時增高的心室舒張期末壓，明顯改善心臟泵血功能[9]。

心肌細胞具有兩個主要特征：一是在細胞內外環境中存在巨大的離子濃度差，二是通過短暫的特異離子通道的開啟和關閉，可以使細胞膜去極化，引起一系列的效應，包括心肌細胞的收縮和舒張。其中鈣離子通道扮演了十分重要的角色。心肌細胞中最主要的有L型和T型兩種鈣離子通道，同屬于電壓依賴性鈣通道，L型鈣離子通道分布于心室肌在內的所有心肌細胞中，其對平臺期的形成、細胞內鈣離子的增多和肌肉收縮期起重要的作用。Ca2+作為心肌興奮收縮偶聯因子，其參與心衰時心肌收縮力降低的主要原因即為轉運失常。本實驗證實氧化苦參堿可激活L型鈣通道，促進Ca2+內流，進而可增加心肌收縮力，是具有正性肌力作用的抗心律失常藥物，適用于心功能不全的患者。

[1]王新峰,李磊,韓國柱.苦參素藥理作用的研究進展[J].醫藥導報,2005,(24)6:483-5.

[2]吳雙,史華,夏時海.氧化苦參堿藥理作用的進展[J].武警醫學院學報,2009,(18)3:238-239.

[3]胡海波.氧化苦參堿對心血管疾病的藥理作用及其機制研究進展[J].中國藥業,2012,(21)13:110-2.

[4]沈映君.中藥藥理學（第2版）[M].人民衛生出版社，2012.

[5]Winslow R.L.,Rice J.,Jafri S.,et al.Mechanisms of altered excitation-contraction coupling in canine tachycardia-induced heart failure,II:model studies.Circ Res1999,84:571-86.

[6]OuditGY,Kassiri Z,Sah R,et al.Themolecular physiology of the cardiac transientoutward potassium current(Ito)in normal and diseasedmyocardium[J].JMolCellCardiol,2001,33:851-872.

[7]楊寶峰，等.藥理實驗方法學（第4版）[M].人民衛生出版社，2010.

[8]陳軍，等.膜片鉗實驗技術[M].科學出版社，2001.

[9]付金國,郭治彬.氧化苦參堿心血管藥理作用的研究[J].江西醫學院學報,2005,(45)3:157-8.