癲癇大鼠海馬線粒體融合分裂相關基因的表達變化

謝南昌，王 翠，張 倩，張宏偉，夏建華，連亞軍

(1.鄭州大學第一附屬醫院神經內科 河南 鄭州 450052;2.鄭州大學第一附屬醫院內科 河南 鄭州 450052)

癲癇是臨床上最常見的神經系統疾病之一，國內外對其發病機制進行了大量研究。以往研究認為，癲癇主要是由興奮性氨基酸活動過度引起的［1］。近年研究發現，中樞神經系統線粒體功能障礙可導致癲癇發作，癲癇發作亦可引起線粒體損傷［2］。線粒體是高度動態的細胞器，在細胞內發生著頻繁的融合與分裂。在哺乳動物中，線粒體融合蛋白1/2(mitofusin 1/2，Mfn1/2)和中國視神經萎縮1(optic atrophy 1，OPA1)分別控制線粒體外膜與內膜的融合;動力相關蛋白1(dynamin-related protein 1，Drp1)和裂殖1同源物(fission 1，Fis1)觸發線粒體的分裂［3］。一方面，融合使完整線粒體與損傷線粒體之間的內容物混合，替換已經損傷的物質，如突變的線粒體 DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)，并恢復其功能。另一方面，線粒體分裂可以隔離線粒體中不可逆轉的損傷，使細胞內功能紊亂的線粒體與具有呼吸活性的線粒體分開，然后被自噬作用清除。且線粒體動力學對于維持線粒體正常的形態、分布和功能十分重要［4］。

既然線粒體融合分裂影響著線粒體功能的多個方面，而我們前期研究發現癲癇發作可使線粒體超微結構受損，呼吸鏈活性下降，線粒體功能異常又導致神經元對癇性損傷更敏感，形成惡性循環［5-6］。因此我們推測線粒體融合分裂失平衡可能在癲癇神經損傷中發揮重要作用，但國內外未見相關報道。本研究應用氯化鋰-匹魯卡品制作大鼠癲癇持續狀態(status epilepticus，SE)模型動態觀察了海馬Mfn2及Drp1 mRNA的表達變化，從線粒體融合分裂角度探討了癲癇神經損傷的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 Light Cycler 2.0實時定量 PCR 儀(Roche);匹魯卡品(Sigma);提取RNA和逆轉錄試劑盒(Promega);SYBR Green熒光染料試劑盒(Takara);其余試劑為國產分析純;引物由上海英駿生物技術有限公司合成，見表1。

表1 QT-PCR引物序列

1.2 動物分組及制模 成年雄性Wistar大鼠(體質量250～300 g，由鄭州大學實驗動物中心提供)，共48只。用隨機數字表法將大鼠隨機分為對照組，SE后2 h、8 h、24 h 組，每組 12 只，6 只用于免疫組化，6 只用于實時定量 PCR(real time quantitative PCR，QTPCR)。所有大鼠腹腔注射氯化鋰125 mg/kg，癲癇組大鼠20 h后給予腹腔注射匹魯卡品25 mg/kg，在匹魯卡品處理前30 min給予皮下注射氫溴酸東莨菪堿1 mg/kg，以拮抗匹魯卡品導致的外周膽堿能反應。對照組注射等量的生理鹽水代替匹魯卡品。按Racine標準判定癲癇發作的程度。1級:動須、咀嚼等面部肌肉抽搐;2級:節律性點頭;3級:單側前肢陣攣、抽搐;4級:站立伴雙前肢陣攣;5級:4級+跌倒伴全身抽搐。SE判斷標準:出現4級以上的發作并保持連續的運動性發作(如節律性點頭、面肌抽搐、肢體陣攣)至少30 min，其間不伴有正常的行為(如理毛)。癇性發作持續1 h時，腹腔注射地西泮(10 mg/kg)終止發作。如果有的小組中大鼠被排除，則即補充相應數量大鼠，以保證每組樣本量。

1.3 尼氏染色檢測海馬神經元損傷 各實驗大鼠用10%的水合氯醛(200 mg/kg，腹腔注射)麻醉后，用4%多聚甲醛(pH 7.4)100 ml灌注固定，迅速斷頭取腦，置于4%多聚甲醛中繼續固定24 h，隨后經包埋、快速冰凍后海馬部位做冠狀面連續切片，厚度為10 μm。按常規方法進行尼氏染色，光鏡下觀察。

1.4 QT-PCR 各實驗大鼠迅速斷頭取腦、分離海馬、液氮保存備用。取液氮保存的海馬標本150～200 mg，按試劑盒說明書提取海馬組織總RNA并反轉錄成cDNA，然后進行實時熒光定量PCR反應。熒光定量 PCR 反應體系包括:RNase Free H2O 6.4 μl，上下游引物各 0.8 μl(10 μmol)，SYBR Green 10 μl，cDNA標本2 μl。反應體系加入毛細管后使用Light Cycler儀器進行PCR擴增。PCR循環參數為:95℃預變性10 s;循環 40次:95℃ 0 s，55℃(β-actin)/56℃(Mfn2)/53℃ (Drp1)10 s，72℃ 15 s，設置溫度改變速率均為20℃/s;95℃ 0 s，65℃ 30 s，95℃ 0.1℃/s(溫度改變速率);40℃ 30 s結束反應。隨機選定某管PCR產物，稀釋為1～1×106梯度濃度，與樣本同時進行PCR，測定并繪制標準曲線。Mfn2、Drp1和β-actin的拷貝數根據標準曲線由計算機軟件自動計算。數據分析:根據目的基因和內參的標準曲線分別計算該樣本絕對定量的拷貝數，相除得到相對值進行比較，即某樣本目的基因的拷貝數/某樣本內參拷貝數，目的基因表達值以Mfn2(或Drp1)/β-actin拷貝數表示。

2 結果

2.1 行為學觀察 對照組和癲癇組大鼠腹腔注射氯化鋰后，均無明顯異常表現。達到Ⅳ～Ⅴ級發作的大鼠歸為癲癇組，36只大鼠中有31只最后達到Ⅳ～Ⅴ級發作，呈現為SE，致癇成功率為86.11%;達到Ⅳ級發作潛伏期為(38.6±16.9)min;大鼠 SE持續1 h后，癲癇終止發作，31只致癇成功的大鼠有3只24 h后行為活動遲鈍，不能主動進食進水，最終死亡。對照組大鼠注射生理鹽水后，未出現癲癇發作。

2.2 尼氏染色檢測 對照組大鼠海馬CA1和CA3區可見大量致密的錐體細胞及顆粒細胞，細胞排列整齊、形態完整，細胞核呈圓形或橢圓形，胞漿內尼氏小體豐富。而SE組大鼠海馬CA1和CA3區神經元數目減少，細胞排列紊亂，部分神經元胞體皺縮，胞漿深染，核固縮，胞漿尼氏小體減少，見表2。

表2 Nissl染色各組大鼠海馬CA1和CA3區存活的錐體細胞數(個/mm2，n=6)

2.3 QT-PCR檢測Mfn2、Drp1 mRNA含量的變化海馬組織Mfn2 mRNA在SE后2、8、24 h表達較對照組顯著降低(P＜0.05);而Drp1 mRNA在 SE后2、8、24 h表達較對照組明顯升高(P＜0.05)，見表3。

3 討論

線粒體是真核細胞內的重要細胞器，其基本功能是通過氧化磷酸化以ATP的形式為細胞提供能量，腦內ATP的消耗多用于神經元的電活動，故來自線粒體的充足能量供應對維持神經元的興奮性和生存具有重要意義。近年研究發現，癲癇發作可損害線粒體的結構和功能，導致神經元對癇性損傷更敏感，形成惡性循環［7-8］。那么癲癇發作是通過什么途徑引起線粒體結構功能改變呢?

表3 Mfn2與Drp1 mRNA的相對表達值(目的基因/β-actin)(n=6)

線粒體在細胞內發生著頻繁的融合與分裂，融合與分裂的相對速度決定了線粒體的形態與數目。Mfn1/2廣泛表達分布于線粒體外膜，在線粒體融合過程中發揮重要作用。Mfn1或Mfn2基因敲除小鼠由于線粒體融合效率低下而導致線粒體片段化，線粒體移動能力減弱，胚胎發育遲滯且胚胎死亡于妊娠中期［9］;Drp1又稱DNM1L蛋白，是調節線粒體分裂的關鍵蛋白，其N端具有GTP酶結構域，C端為GTP酶效應結構域，中間是Dynamin同源結構域。Drp1主要定位于細胞漿，并以多聚體的形式存在。受線粒體外膜分子Fis1的招募而轉位至線粒體外膜，并且富集于線粒體潛在的分裂位點形成指環結構，逐漸壓縮直至線粒體斷裂，產生兩個不同膜電位(ΔΨm)的線粒體碎片，其中低膜電位、具有融合缺陷的線粒體碎片通過自噬被清除。線粒體分裂后，Drp1重新回到胞漿，如此循環反復［10］。因此，線粒體分裂可以隔離線粒體中不可逆轉的損傷，使細胞內功能紊亂的線粒體與具有呼吸活性的線粒體分開，然后被自噬作用清除［11-12］。本研究發現:癲癇發作后Mfn2 mRNA表達較對照組明顯降低，而Drp1 mRNA表達顯著升高，提示癲癇發作中存在線粒體融合分裂的失平衡。線粒體融合分裂平衡對于維持線粒體的形態結構和功能有重要作用，其融合分裂平衡的紊亂將導致線粒體功能障礙，表現為ATP生成減少、氧自由基(reactive oxygen species，ROS)產生增多等，導致神經元對癇性損傷更敏感，形成惡性循環［13］。因此，本研究提示線粒體融合分裂失平衡可能在癲癇神經損傷中發揮重要作用。

近幾年的大量研究提示，線粒體融合分裂與細胞凋亡密切相關［14］，凋亡早期線粒體網絡往往發生明顯的片段化，超表達介導線粒體分裂的分子Drp1或Fis1可以促進線粒體分裂，同時誘導細胞凋亡，而抑制Drp1或Fis1則可以抑制凋亡［15-16］。與此相一致的是，超表達介導線粒體融合的分子Mfn1/2或OPA1可以促進線粒體融合，同時抑制凋亡，而抑制Mfn1/2或OPA1則可促進凋亡［17-18］。這些都說明線粒體融合分裂參與了凋亡過程。

綜上，癲癇發作可引起線粒體融合分裂基因Mfn2及Drp1在基因水平的表達改變，說明線粒體融合分裂失平衡可能在癲癇導致的線粒體結構及功能紊亂中發揮重要作用。而“癲癇發作—線粒體融合分裂失平衡—線粒體損傷—加重癲癇發作”，這種惡性循環很好地解釋了癲癇與線粒體的關系，并提示我們探索是否可以通過調控線粒體融合分裂途徑阻止這種惡性進程。因此，本研究為癲癇神經損傷的防治提供一種新思路、新靶點。

［1］ Vincent P，Mulle C.Kainate receptors in epilepsy and excitotoxicity［J］.Neuroscience，2009，158(1):309-323.

［2］ Kunz W S.The role of mitochondria in epileptogenesis［J］.Curr Opin Neurol，2002，15(2):179-184.

［3］ Chan D C.Mitochondrial fusion and fission in mammals［J］.Annu Rev Cell Dev Biol，2006，(22):79-99.

［4］ Ong S B，Hausenloy D J.Mitochondrial morphology and cardiovascular disease［J］.Cardiovasc Res，2010，88(1):16-29.

［5］ Xue Y，Xie N，Lin Y，et al.Role of PI3K/Akt in diazoxide preconditioning against rat hippocampal neuronal death in pilocarpine-induced seizures［J］.Brain Res，2011，(1383):135-140.

［6］ Xue Y，Xie N，Cao L，et al.Diazoxide preconditioning against seizure-induced oxidative injury is via the PI3K/Akt pathway in epileptic rat［J］.Neurosci Lett，2011，495(2):130-134.

［7］ Lin Y，Han Y，Xu J，et al.Mitochondrial DNA damage and the involvement of antioxidant defense and repair system in hippocampi of rats with chronic seizures［J］.Cell Mol Neurobiol，2010，30(6):947-954.

［8］ Lin Y，Xu J，Cao L，et al.Mitochondrial base excision repair pathway failed to respond to status epilepticus induced by pilocarpine［J］.Neurosci Lett，2010，474(1):22-25.

［9］ Chen H，Detmer S A，Ewald A J，et al.Mitofusins Mfn1 and Mfn2 coordinately regulate mitochondrial fusion and are essential for embryonic development［J］.J Cell Biol，2003，160(2):189-200.

［10］ Smirnova E，Griparic L，Shurland D L，et al.Dynamin-related protein Drp1 is required for mitochondrial division in mammalian cells［J］.Mol Biol Cell，2001，12(8):2245-2256.

［11］ Gomes L C，Scorrano L.High levels of Fis1，a pro-fission mitochondrial protein，trigger autophagy［J］.Biochim Biophys Acta，2008，1777(7-8):860-866.

［12］ Twig G，Hyde B，Shirihai O S.Mitochondrial fusion，fission and autophagy as a quality control axis:the bioenergetic view［J］.Biochim Biophys Acta，2008，1777(9):1092-1097.

［13］ Benard G，Bellance N，James D，et al.Mitochondrial bioenergetics and structural network organization［J］.J Cell Sci，2007，120(Pt 5):838-848.

［14］ Karbowski M，Youle R J.Dynamics of mitochondrial morphology in healthy cells and during apoptosis［J］.Cell Death Differ，2003，10(8):870-880.

［15］ James D I，Parone P A，Mattenberger Y，et al.hFis1，a novel component of the mammalian mitochondrial fission machinery［J］.J Biol Chem，2003，278(38):36373-36379.

［16］ Lee Y J，Jeong S Y，Karbowski M，et al.Roles of the mammalian mitochondrial fission and fusion mediators Fis1，Drp1，and Opa1 in apoptosis［J］.Mol Biol Cell，2004，15(11):5001-5011.

［17］ Olichon A，Baricault L，Gas N，et al.Loss of OPA1 perturbates the mitochondrial inner membrane structure and integrity，leading to cytochrome c release and apoptosis［J］.J Biol Chem，2003，278(10):7743-7746.

［18］ Sugioka R，Shimizu S，Tsujimoto Y.Fzo1，a protein involved in mitochondrial fusion，inhibits apoptosis［J］.J Biol Chem，2004，279(50):52726-52734.