4-氨基安替比林法和鄰-甲聯(lián)苯胺法測定游離血紅蛋白結(jié)果比較

冀 慧

(安陽中心血站 河南 安陽 455000)

游離血紅蛋白(FHb)含量測定是血站全血及成分血質(zhì)量要求和質(zhì)量控制的檢查項(xiàng)目之一，也是臨床溶血性疾病和溶血性輸血反應(yīng)常用的輔助檢查方法。2012年新版《全血及成分血質(zhì)量要求 GB18469-2012》［1］中對所有含紅細(xì)胞的制品均要求進(jìn)行血漿或上清液FHb的含量測定。《血站技術(shù)操作規(guī)程2012版》［2］推薦方法為鄰-甲聯(lián)苯胺法，該方法操作步驟復(fù)雜，試劑需新鮮配制，影響因素較多，重復(fù)性和穩(wěn)定性較差。目前部分血液中心和血站使用三波長法［3］、紫外分光光度法［4］等進(jìn)行FHb的測定，但未發(fā)現(xiàn)使用4-氨基安替比林比色法測定FHb的含量，4-氨基安替比林比色法目前有市售的試劑盒，操作簡單快捷。筆者比較了鄰-甲聯(lián)苯胺法和4-氨基安替比林法測定FHb的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性及測量時(shí)的注意事項(xiàng)，探討采供血機(jī)構(gòu)測定FHb含量最適宜的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器 分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)V-18D);37℃恒溫培養(yǎng)箱(上海新苗DNP-9162BS-Ⅲ型);血球計(jì)數(shù)儀(日本KX-21)。

1.2 試劑及樣品

1.2.1 一般試劑準(zhǔn)備:鄰-甲聯(lián)苯胺(分析純，批號:20130723，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所);30%過氧化氫溶液(分析純，批號20130518，天津市津北精細(xì)化工有限公司);冰醋酸溶液(分析純，批號20121113，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)。鄰-甲聯(lián)苯胺溶液:稱取鄰-甲聯(lián)苯胺200 mg，溶于冰醋酸60 ml，溶解后加蒸餾水至100 ml，保存于冰箱中，可用8～12周。1%過氧化氫溶液:由30%的過氧化氫溶液配制而成，現(xiàn)用現(xiàn)配。10%冰醋酸溶液:由冰醋酸溶液用蒸餾水稀釋而成，現(xiàn)用現(xiàn)配。血漿游離血紅蛋白測定試劑盒(北京瑞爾達(dá)生物科技有限公司，20131202);全血質(zhì)控物(MAKER，111312G);KX-21 稀 釋 液 (日 本，20130805);KX-21溶血?jiǎng)?日本，20130731)。

1.2.2 血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的制備:新鮮全血5 ml離心，1 500 g離心15 min后棄去上層血漿及白膜層;加3倍體積0.9%氯化鈉溶液，混勻后離心，430 g離心10 min，棄去上清液，重復(fù)3次得到壓積紅細(xì)胞;加15 ml蒸餾水，輕搖30 min后離心，10 000 g離心30 min，棄去下層沉淀［5］，用血球計(jì)數(shù)儀測其濃度;用0.9%氯化鈉溶液調(diào)節(jié)濃度至100 g/L，于低溫冰箱中保存，得到FHb標(biāo)準(zhǔn)品儲備液［6］，用時(shí)稀釋成相應(yīng)濃度。

1.3 方法

1.3.1 鄰-甲聯(lián)苯胺操作方法［7］:試劑處理后，迅速在435 nm波長下比色，光徑10 mm，空白調(diào)零，結(jié)果計(jì)算:FHb/(mg/L)=A樣品/A標(biāo)準(zhǔn)×100。正常人群FHb參考值 ＜40 mg/L［7］，解凍紅細(xì)胞 FHb參考值≤1 000 mg/L［1］，紅細(xì)胞制品中FHb的含量一般都要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常人群參考值。具體步驟見表1。

表1 鄰-甲聯(lián)苯胺法操作步驟

1.3.2 4-氨基安替比林操作方法:按照血漿游離血紅蛋白測定試劑盒說明書進(jìn)行操作(北京瑞爾達(dá)生物科技有限公司)。在505 nm波長下比色，光徑10 mm，空白調(diào)零，結(jié)果計(jì)算:FHb(mg/L)=A樣品/A標(biāo)準(zhǔn)×100，見表2。

1.3.3 線性范圍:將FHb標(biāo)準(zhǔn)品(100 g/L)用0.9%氯化鈉溶液分別稀釋成 50、100、150、200、250 mg/L，用鄰-甲聯(lián)苯胺比色法，平行分析3次;將FHb標(biāo)準(zhǔn)品(100 g/L)用0.9%氯化鈉溶液分別稀釋成50、100、200、300、400 mg/L，用4-氨基安替比林比色法，平行分析3次。

表2 4-氨基安替比林法操作步驟

1.3.4 精密度:將FHb標(biāo)準(zhǔn)品(100 g/L)用0.9%氯化鈉溶液分別稀釋成100、500、1 000 mg/L，用兩種方法分別測定其FHb含量，每份樣品平行分析5次。統(tǒng)計(jì)分析5個(gè)平行樣品之間的變異性。

1.3.5 準(zhǔn)確性:將FHb標(biāo)準(zhǔn)品(100 g/L)用0.9%氯化鈉溶液分別稀釋成100、500、1 000 mg/L，用兩種方法分別測定其FHb含量，每份樣品平行分析3次，統(tǒng)計(jì)分析測定的準(zhǔn)確性。

1.3.6 穩(wěn)定性:將FHb標(biāo)準(zhǔn)品(100 g/L)用0.9%氯化鈉溶液分別稀釋成200、400、800 mg/L，用兩種方法分別測定其 FHb含量及放置5、10、30、60 min后的FHb吸光度值。

1.4 數(shù)據(jù)分析 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0進(jìn)行處理，F(xiàn)Hb含量與吸光度的關(guān)系采用相關(guān)性分析，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 線性范圍 鄰-甲聯(lián)苯胺法:FHb≤250 mg/L時(shí)有良好的線性關(guān)系(r=0.996，P ＜0.05);4-氨基安替比林法:FHb≤400 mg/L時(shí)有良好的線性關(guān)系(r=0.999，P ＜0.05)，見表 3。4-氨基安替比林法的線性范圍大于鄰-甲聯(lián)苯胺法的線性范圍，用線性范圍寬的4-氨基安替比林法測定高濃度FHb含量時(shí)可減少對測定樣品的稀釋倍數(shù)。

表3 兩種方法測定標(biāo)準(zhǔn)品含量與吸光度關(guān)系

2.2 精密度 鄰-甲聯(lián)苯胺法:低濃度樣品 CV=4.01%，中濃度樣品 CV=8.91%，高濃度樣品 CV=7.52%;4-氨基安替比林法:低濃度樣品CV=2.61%，中濃度樣品CV=3.63%，高濃度樣品CV=4.61%。兩種方法變異系數(shù)均≤10%，但4-氨基安替比林法在測定高中低不同濃度樣品時(shí)的變異系數(shù)相差不大，鄰-甲聯(lián)苯胺法在測定高中濃度樣品時(shí)變異系數(shù)相差較大，4-氨基安替比林法的試驗(yàn)重復(fù)性要優(yōu)于鄰-甲聯(lián)苯胺法，見表4。

表4 兩種方法測定精密度試驗(yàn)結(jié)果(mg/L)

2.3 準(zhǔn)確性 鄰-甲聯(lián)苯胺法(平均值為93.02%)和4-氨基安替比林法(平均值為93.32%)在測定高中低不同濃度樣品時(shí)的準(zhǔn)確度相差不大，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見表5。

表5 兩種方法測定準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

2.4 穩(wěn)定性 鄰-甲聯(lián)苯胺法反應(yīng)結(jié)束后，高中低3個(gè)濃度樣品的吸光度值隨時(shí)間的不斷延長而不斷降低，呈直線向下的趨勢，見圖1;4-氨基安替比林法反應(yīng)結(jié)束后，高中低3個(gè)濃度樣品的吸光度值沒有太大變化，基本上呈直線趨勢，見圖2。4-氨基安替比林法因試劑中加入一定量的穩(wěn)定劑，反應(yīng)結(jié)束后顏色變化很穩(wěn)定。4-氨基安替比林法的穩(wěn)定性要大大優(yōu)于鄰-甲聯(lián)苯胺法。

圖1 鄰-甲聯(lián)苯胺法測定結(jié)果穩(wěn)定性

3 討論

圖2 4-氨基安替比林法測定結(jié)果穩(wěn)定性

FHb是血漿中血紅蛋白的含量，是血液保存質(zhì)量測定的常規(guī)指標(biāo)。在血液采集和血液成分制備過程中有時(shí)會(huì)造成紅細(xì)胞破裂而釋放出血紅蛋白。如輸入的血液中含有過量的FHb，會(huì)對機(jī)體造成傷害，主要原因在于Hb中的血紅素可引起自由基產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致組織損傷，比較嚴(yán)重的后果是對神經(jīng)系統(tǒng)具有毒性作用［8］;另外，輸入過量的Hb還可迅速結(jié)合掉循環(huán)系統(tǒng)中的NO，引起血管無法舒張，最終導(dǎo)致受血者血壓升高，缺血缺氧，甚至威脅生命［9］。2012年新版《全血及成分血質(zhì)量要求GB18469-2012》中對血站制備的所有含紅細(xì)胞的制品均要求進(jìn)行血漿或上清液FHb的含量測定。《血站技術(shù)操作規(guī)程2012版》推薦方法為鄰-甲聯(lián)苯胺法，該方法操作步驟復(fù)雜，試劑需新鮮配制，影響因素較多，而且所用試劑冰醋酸和過氧化氫對人體皮膚和黏膜均有刺激性和腐蝕性，且鄰-甲聯(lián)苯胺屬于有機(jī)有毒品，對人體還有一定的致癌作用。因冰醋酸具有揮發(fā)性，過氧化氫易氧化分解，所以冰醋酸溶液和過氧化氫溶液均需要新鮮配制，否則二者含量都會(huì)隨保存時(shí)間的增加而不斷減少，引起樣品吸光度值變小。我們在用鄰-甲聯(lián)苯胺法測定較多樣品時(shí)，如測定時(shí)間超過3 h，則需重新配制過氧化氫溶液和冰醋酸溶液，并將過氧化氫溶液配置后盛放于棕色瓶中避光保存;鄰-甲聯(lián)苯胺溶液雖說可在冰箱保存8～12周，但我們發(fā)現(xiàn)鄰-甲聯(lián)苯胺溶液在保存過程中顏色會(huì)逐漸加深，如顏色明顯變深，則需重新配制。4-氨基安替比林法目前有市售的整套試劑盒，無需新鮮配制試劑，大大簡化了操作步驟，減少了有害試劑對人體的傷害。因試劑中含有穩(wěn)定劑，結(jié)果穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好。綜上所述，4-氨基安替比林法相對于鄰-甲聯(lián)苯胺法更適合采供血機(jī)構(gòu)測定FHb含量使用。

［1］ 中華人民共和國衛(wèi)生部.全血及成分血質(zhì)量要求［S］.GB18469-2012.

［2］ 中華人民共和國衛(wèi)生部.血站技術(shù)操作規(guī)程(2012版)［S］.衛(wèi)醫(yī)政發(fā)［2012］1號.

［3］ 于清，王紅，劉嘉馨，等.游離血紅蛋白測定:三波長法和鄰聯(lián)甲苯胺法的比較研究［J］.中國輸血雜志，2012，25(2):138-141.

［4］ 王莉，張淑琴，趙君，等.紫外分光光度法檢測血漿游離血紅蛋白［J］.中國輸血雜志，2006，19(6):477-479.

［5］ Cripps C M.Rapid method for the estimation of plasma haemoglobin levels［J］.J Clin Pathol，1968，21(1):110-112.

［6］ 掌友湖，梁啟忠，程玉根.全血質(zhì)控物配制標(biāo)準(zhǔn)液在血漿游離血紅蛋白測定中的應(yīng)用［J］.中國輸血雜志，2009，22(10):823-824.

［7］ 中華人民共和國衛(wèi)生部醫(yī)政司.全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程［M］.第3版.南京:東南大學(xué)出版社，2006:258.

［8］ 吳波，方國恩.游離血紅蛋白主要測定方法及輸入過量對機(jī)體影響的研究進(jìn)展［J］.實(shí)用醫(yī)藥雜志，2008，25(5):612-614.

［9］ Gross S S，Lane P.Physiological reactions of nitric oxide and hemoglobin:a radical rethink［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1999，96(18):9967-9969.