經皮穴位電刺激對過度訓練大鼠性腺軸的影響及機制研究

張彩,楊華元

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經皮穴位電刺激對過度訓練大鼠性腺軸的影響及機制研究

張彩,楊華元

(上海中醫藥大學,上海 201203)

觀察經皮穴位電刺激(transcutanclus electrical acupoint stimulation,TEAS)對過度訓練大鼠性腺軸(HPG)的調控作用,并探討其機制。將32只雄性SD大鼠,隨機分為空白對照組、造模前干預組、造模后干預組和模型組,每組8只。采用遞增強度的跑臺建立過度訓練大鼠模型。兩個干預組分別在造模前和造模后進行TEAS干預。實驗結束時取全血、下丘腦、垂體、杏仁核進行檢測。熒光定量PCR檢測下丘腦促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing hormone,GnRH)mRNA與垂體GnRH-R mRNA的表達;ELISA法檢測黃體生成素(Luteinizing Hormone, LH)、睪酮(Testosterone,T)濃度;ELISA法檢測杏仁核蛋白激酶C(Protein kinase C, PKC)、環磷酸鳥苷(cyclic Guanosine Monophosphate,cGMP)活性。與空白對照組比較,模型組垂體GnRH-R mRNA表達顯著下降(＜0.05),T明顯降低(＜0.05)提示實驗中所采用的訓練方案抑制了HPG軸的功能。造模前干預組與模型組比較,可以顯著增加垂體GnRH-R mRNA的表達(＜0.05);造模后TEAS干預可以顯著增加運動機體下丘腦GnRH mRNA的表達與T水平(＜0.05,＜0.01)。與模型組比較,造模前干預組可以顯著提高杏仁核PKC活性(＜0.01)。造模后干預組杏仁核cGMP活性顯著高于模型組(＜0.05)。過度訓練大鼠HPG軸功能處于抑制狀態。TEAS干預過度訓練機體,可以提高HPG軸功能,但不同時間段進行干預,所影響的HPG軸的靶點有所不同。造模前TEAS干預運動機體是通過增加杏仁核PKC活性調整HPG功能,而造模后干預是通過加強杏仁核cGMP活性而調整HPG軸功能。

針刺療法;經皮穴位電刺激;杏仁核;大鼠;過度訓練;性腺軸;運動性疲勞(肌肉疲勞)

隨著全球經濟的飛速發展,競技體育逐漸成為國家強盛的一個重要標志,比賽競爭越來越激烈,各個訓練隊、運動員為了追求成績而不斷增加訓練負荷與強度,所以過度訓練的現象在運動隊中非常普遍。過度訓練是運動負荷與機體機能不相適應,以至疲勞連續累積而引起的一系列功能紊亂或病理狀態[1]。過度訓練不僅會降低運動員的成績,甚至會損傷運動機體,斷送運動員的運動生涯。如何防治過度訓練成為體育科學與運動醫學的重要研究方向。運動與機體下丘腦-垂體-性腺軸(hypothalamic pituitary-gonad axis, HPG)關系密切,過度訓練會抑制HPG軸功能[2-3]。而采用中藥、針灸等中醫手段可以調整HPG軸的功能,提高運動機能,防治過度訓練的發生[2,4]。但中藥存在成分不明確、口味較苦的弊端,針刺又是一種微創的干預方法,很多運動員不愿意接受。經皮穴位電刺激(transcutanclus electrical acupoint stimulation, TEAS)是將經皮電神經刺激療法(transcutanclus electrical nerve stimulation,TENS)與針灸穴位相結合的新型針灸治療方法,其克服了中藥與針灸的弊端。本研究以過度訓練大鼠為研究對象,觀察TEAS對過度訓練機體HPG軸的影響。并從調控下丘腦分泌功能的杏仁核內信息轉導的變化[5-7],探究TEAS調控HPG軸的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SD大鼠32只,清潔級,體重(250±10) g,由中國科學院實驗動物中心提供,動物許可證編號[SCXK(滬2008-0016)]。訓練過程中剔除出現以下兩種情況的動物,①連續3 d都不能適應跑臺的大鼠;②在訓練過程中嚴重受傷的大鼠。

1.2 實驗試劑

大鼠環磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosph- ate,cGMP)、大鼠蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)、大鼠促黃體生成素(luteinizing hormone,LH)及酶聯免疫分析試劑盒,美國R&D公司提供;大鼠血清睪酮(testosterone,T)放射免疫試劑盒,北京北方生物技術研究所提供;Trizol,美國Invitrogen公司提供;逆轉錄cDNA合成試劑盒,立陶宛MBI公司(Fermentas)提供;SYBR Green PCR試劑盒,捷瑞生物科技公司提供;引物設計合成,捷瑞生物科技公司提供。

1.3 實驗儀器

韓氏穴位神經刺激儀(北京普康醫藥科技發展公司,型號LH402);六通道動物跑臺(東西儀器科技有限公司,型號SLY-RTML);PCR儀(美國ABI公司,型號Step one Plus PCR);智能化g計數器(北京核儀器廠,型號FT646A3);多功能細胞定量分析儀(德國BEC KMAN公司,型號QUANTA SC);透射電子顯微鏡(荷蘭Philips,型號Tecnai-12 Biotwin);酶標儀(美國BIO TEK公司,型號Bio-tek Synergy HT)。

1.4 實驗方法

1.4.1 訓練模式

參考既往過度訓練方案[8-11],本課題采用跑臺的運動方式,進行遞增強度的模式,建立過度訓練大鼠模型。大鼠適應性喂養6 d后開始訓練,訓練持續8星期。運動方案見表1。

表 1 大鼠過度訓練模型運動方案

1.4.2 實驗分組方法

32只SD雄性大鼠隨機分為空白對照組、造模前干預組、造模后干預組和模型組,每組8只。空白對照組不訓練、不干預,常規飼養;造模前干預組在TEAS干預2星期后,按照訓練表1訓練計劃進行訓練;造模后干預組按表1訓練計劃訓練8星期,再進行TEAS干預2星期;模型組按表1訓練方案進行訓練8星期,建立過度訓練大鼠模型。

1.4.3 經皮穴位電刺激干預方法

經過文獻篩選,最終選擇雙側后三里(后肢內踝高點直上10 mm處)與三陰交(后肢膝關節處下方約5 mm)。取穴方法參照《大鼠穴位圖譜》[12]。將大鼠穴位局部毛剃除,后三里直刺7 mm,三陰交直刺5 mm。將電極固定于相應部位。治療參數為連續波,頻率為2 Hz,強度為5 mA,治療20 min。

1.4.4 動物處理方法

實驗干預后,大鼠經0.4%戊巴比妥腹腔注射進行麻醉,麻醉后左心室取血,取血后暴露心臟,左心室插管,剪開右心耳,先以生理鹽水迅速灌沖,再灌注4%多聚甲醛進行固定,取出下丘腦、垂體、杏仁核,液氮保存。

1.4.5 指標檢測方法

①血清T采用放射免疫法測量;②下丘腦GnRH mRNA檢測采用熒光定量PCR方法,第一步為組織總RNA的抽提;第二步為逆轉錄cDNA。③采用熒光定量法檢測垂體GnRH-R mRNA;④采用雙抗體夾心法測定標本中大鼠促黃體激素(LH)水平;⑤采用酶聯免疫分析(ELISA)檢測cGMP與PKC。

1.5 統計學方法

采用一般描述性分析,并利用SPSS13.0進行方差分析,計量資料采用均數±標準差表示。

2 結果

2.1 各組大鼠HPG軸指標結果比較

2.1.1 各組大鼠下丘腦GnRH mRNA表達比較

造模后干預組大鼠下丘腦GnRH mRNA的表達最強,與模型組比較,差異具有統計學意義(＜0.05),提示模后進行TEAS干預能增強運動機體下丘腦分泌GnRH的趨勢。詳見表2

表 2 各組大鼠下丘腦GnRH mRNA表達比較 (±s)

注:與模型組比較1)＜0.05

2.1.2 各組大鼠垂體GnRH-R mRNA表達比較

模型組大鼠垂體GnRH-R mRNA表達顯著低于空白對照組(＜0.05),提示該實驗中的大強度訓練一定程度上抑制了垂體GnRH-R基因的表達。造模前干預組大鼠垂體GnRH-R mRNA含量顯著高于模型組(＜0.05),提示TEAS預刺激可以促進機體垂體GnRH-R的分泌。詳見表3。

表 3 各組大鼠下丘腦GnRH-R mRNA表達比較 (±s)

注:與空白對照組比較1)＜0.05;與造模前干預組比較2)＜0.05

2.1.3 各組大鼠血清LH及血清T比較

各組大鼠血清LH含量比較,差異均無統計學意義(＞0.05)。模型組大鼠血清T含量明顯低于空白對照組(＜0.05),提示本研究所采用的訓練方案負荷過大,抑制了機體T的分泌。而造模后干預組大鼠血清T含量與模型組比較,差異具有統計學意義(＜0.05),提示造模后TEAS干預能提高運動機體血清T的含量。詳見表4。

表 4 各組大鼠血清LH及血清T含量比較 (±s)

注:與模型組比較1)＜0.05;與空白對照組比較2)＜0.05

2.1.4 各組大鼠杏仁核內PKC及cGMP活性比較

表 5 各組大鼠杏仁核內PKC及cGMP活性比較 (±s)

注:與模型組比較1)＜0.01,2)＜0.05

模型組大鼠杏仁核內PKC及cGMP含量均低于空白對照組,但差異均無統計學意義(＞0.05),提示過度訓練可能導致大鼠杏仁核內PKC及cGMP活性下降。

造模前干預組大鼠杏仁核內PKC含量與模型組比較,差異具有統計學意義(＜0.01)。造模后干預組大鼠杏仁核內cGMP含量與模型組比較,差異具有統計學意義(＜0.05)。詳見表5。

4 討論

本課題以防治過度訓練為著眼點切入,采用TEAS在實驗的不同時間段干預運動機體,觀察TEAS對過度訓練機體HPG軸各級分泌功能的影響,并研究杏仁核內信息轉導的變化,探析杏仁核內信息轉導的變化對HPG軸的影響。國內外研究證實運動與HPG軸關系密切[13],其中與運動關系密切的T的分泌便是由HPG軸中第三級睪丸分泌。HPG軸最上級為下丘腦,下丘腦分泌GnRH,通過垂體門脈血流到達腺垂體,與垂體上的GnRH受體結合,促進垂體分泌LH、FSH,LH經血液循環到達性腺(睪丸),調節性腺的分泌T活動,最終影響機體的運動機能。下丘腦中許多神經元具有內分泌功能,可以分泌激素。GnRH主要由下丘腦的弓狀核、內側視前區與室旁核等處分泌。GnRH的主要作用是促進腺垂體合成和分泌促性腺激素,而下丘腦GnRH mRNA表達可以直接反應下丘腦內GnRH的含量。過度訓練能反饋性抑制HPG軸的功能,引起下丘腦內GnRH mRNA表達下降[14]。研究選擇足三里與三陰交兩個穴位,足三里為養生保健常用穴,是多氣多血足陽明胃經之合穴,有調脾胃、養氣血、壯機體和助消化的作用。很多研究證實針刺足三里具有緩解運動性疲勞,提高運動機能的作用[15]。三陰交屬足太陰脾經,是肝經、脾經、腎經的交會穴,具有健脾、補肝、益腎的功效。沈梅紅等[16]報道針刺骨折模型大鼠三陰交穴能增高血清T含量。TEAS干預足三里與三陰交,具有調補脾胃、補益肝腎的作用,可以緩解或治療“力勞”。而HPG軸的功能與中醫學“腎”的功能關系密切[17],TEAS干預機體能夠增強HPG軸的各級分泌功能。

垂體上的促性腺激素細胞膜上有GnRH的受體,GnRH與受體結合后,促進下級激素表達。GnRH-R是GnRH發揮生物效應的關鍵介導者,任何影響GnRH受體基因表達及蛋白表達量的因素均可影響GnRH的作用,從而影響HPG軸的功能。LH是屬于腺垂體分泌的激素,作用于睪丸,促進睪丸分泌T。LH則主要作用于間質細胞,LH還參與激素分泌的調節,睪丸間質細胞膜上存在LH受體。當腺垂體分泌的LH與間質細胞膜上的LH受體結合后,T合成增加。有研究提示高強度運動會抑制機體垂體分泌LH。本研究結果顯示,模型組大鼠血清LH低于空白對照組,但差異無統計學意義(＞0.05),這主要是因為大負荷訓練抑制垂體LH的分泌。T是一種類固醇激素,由男性的睪丸或女性的卵巢分泌,具有維持肌肉質量、維持骨質密度及強度及增強體能等作用。T可促進同化代謝,促進蛋白質的合成,使肌肉壯大,刺激紅細胞合成,加速血紅蛋白的合成,加速體內抗體的形成,增強免疫功能和抗感染能力。T對提高力量、速度和耐力的訓練效果均有益處,血清T水平是評定運動員機能狀態的重要指標。過度訓練會引起T水平下降,從而引起人體的運動機能下降,所以T下降可以作為機體過度訓練的標志。TEAS造模后干預,具有治療過度訓練的作用,通過調補肝腎可以提高大鼠血清T含量,促進蛋白合成,增強大鼠的免疫力,增強其運動能力的作用。綜上分析,模型組大鼠垂體GnRH-R mRNA的表達顯著下降,垂體分泌的LH有下降趨勢,睪丸分泌的T顯著下降,說明本實驗的訓練方案抑制了運動機體HPG軸的各級分泌功能。

在實驗的不同時間段進行TEAS干預均可以不同程度的提高運動機體HPG軸各級分泌功能,但作用的靶點不同。訓練前的干預,即“預刺激”,可以提高大鼠垂體GnRH-R mRNA的表達,增強垂體分泌LH與睪丸分泌T的功能。造模后TEAS干預,可以增加大鼠下丘腦GnRH mRNA的表達,提高大鼠的血清T與LH。從中醫學理論分析,造模前干預,可以預先激發機體的經絡之氣,增強肝脾腎功能,進而提高大鼠的運動機能。而造模后干預則對過度訓練大鼠具有治療作用,通過調補肝腎,調控改善大鼠的運動機能。

目前開展的很多相關研究從海馬內神經傳導變化,探究各種干預措施對運動機體的影響機制。本研究從杏仁核內信息的轉導,探究TEAS調控過度訓練大鼠HPG軸的中樞機制之一。杏仁核通過內側核群的神經纖維影響下丘腦功能,而HPG軸的中樞部位為下丘腦,所以杏仁核對HPG軸具有一定的調控作用。本研究觀察杏仁核內PKC、cGMP的活性改變,探究TEAS調控過度訓練大鼠HPG中樞機制。PKC是杏仁核信息傳遞的中間物質,其活性增強,提示杏仁核內信息傳遞增強,反之則信息傳遞減慢。而PKC活性下降,又會影響杏仁核內信息傳導,進而抑制下丘腦分泌功能,從而抑制HPG軸功能。TEAS在不同的時間段干預過度訓練機體,均可提高杏仁核PKC活性,尤其是造模前干預,PKC活性高于模型組(＜0.01),提示造模前TEAS干預訓練機體,可以通過增強中樞杏仁核內PKC活性,促進杏仁核內神經遞質的釋放,增強神經突觸可塑性與基因表達等作用,進而影響下丘腦分泌功能,增強HPG軸功能,進而最終保護運動機體避免出現過度訓練。

cGMP具有信息傳導作用,一般稱為第二信使。cGMP可以通過調控Ca2+的濃度,影響杏仁核神經元的活性,影響下丘腦的分泌功能,最終調控HPG軸的各級分泌功能。在不同的時間段,TEAS干預運動機體,只有在造模后TEAS干預運動機體可以明顯增強cGMP活性。提示造模后TEAS干預,可以提高杏仁核內cGMP活性,促進杏仁核內信息傳遞,加強下丘腦內分泌功能,進而增強HPG軸的各級功能,提高運動能力。

綜上所述,TEAS干預運動機體可以通過調整HPG軸的各級分泌功能,防治過度訓練的發生,提高運動機能,但造模前與造模后干預過度訓練機體起作用的靶點與作用機制有所不同。

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Study of the Effect of TEAS on the HPG Axis and the Mechanism of Its Action in Overtraining Rats

,-.

,201203,

To investigate the regulating effect of transcutanclus electrical acupoint stimulation (TEAS) on the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis and explore the mechanism of its action.Thirty-two male SD rats were randomly allocated to black control, before-model making intervention, after-model making intervention and model groups, 8 rats each. A rat model of overtraining was made by increasing intensity treadmill running. The two intervention groups were given TEAS before and after model making, respectively. At the end of experiment, the whole blood, hypothalamus, pituitary and amygdaloid nucleus were taken for examination. The expressions of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) mRNA in the hypothalamus and GnRH-R mRNA in the pituitary were examined by fluorescent quantitative PCR. Luteinizing hormone (LH) and testosterone (T) concentrations and amygdala protein kinase C (PKC) and cyclic guanosine monophosphate (cGMP) activities were measured by ELISA.The expression of GnRH-R mRNA in the pituitary and T concentration decreased significantly in the model group compared with the blank control group (both＜0.05), indicating that the training scheme used in the experiment inhibited the function of HPG axis. Pituitary expression of GnRH-R mRNA increased significantly in the before-model making intervention group compared with the model group (＜0.05). TEAS intervention after model making significantly increased hypothalamic expression of GnRH-R mRNA and T levels in the moving bodies (＜0.05,＜0.01). Compared with the model group, amygdala PKC activity increased significantly in the before-model making intervention group (＜0.01) and amygdala cGMP activity increased significantly in the after-model making intervention group (＜0.05).The function of HPG axis is in an inhibitory state in overtraining rats. TEAS intervention can improve the function of HPG axis in overtraining bodies, but the target of HPG axis it affects is different if the intervention is made in a different time period. TEAS intervention before model making regulates the function of HPG axis by increasing amygdala PKC activity and TEAS intervention after model making regulates the function of HPG axis by increasing amygdala cGMP activity in moving bodies.

Acupuncture therapy; Transcutanclus electrical acupoint stimulation; Amygdaloid nucleus; Rats; Overtraining; Hypothalamic-pituitary-gonadal axis; Exercise-induced fatigue (muscle fatigue)

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2014.07.0680

1005-0957(2014)07-0680-04

張彩(1979 - ),女,講師

2014-01-28