急性腦梗死患者外周血T、B 淋巴細胞亞群和NK 細胞的變化

楊金偉，田朝暉，韓呈武，于雪瑩，曹永彤

（1.中日友好醫院 檢驗科；2.神經內科，北京 100029）

急性腦梗死（acute cerebral infarction，ACI）是中樞神經系統的急性損傷性改變， 由各種原因的腦血液供應障礙引起。目前，關于中樞神經系統損傷與免疫系統關系的研究中，對于T 淋巴細胞研究比較多，且國內外研究結果一致認為ACI 患者T 淋巴細胞總數減少。 但對于CD4+T/CD8+T 研究結果并不一致， 同時對NK 細胞和B 淋巴細胞的研究很少。 本研究通過對29 例ACI 患者的T、B淋巴細胞亞群和自然殺傷細胞 （natural killer，NK）的檢測，探討ACI 患者免疫系統的改變，以期為腦梗死患者免疫系統的研究提供更多依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2011 年1 月～2013 年12 月我院神經內科住院的29 例ACI 患者作為研究對象， 入院日期距發?。?d，入院前3 個月內未使用抗血小板、擴血管藥物，未使用激素和免疫抑制劑，排除感染性疾病、腫瘤、冠心病、免疫性疾病、外傷。 診斷符合全國第四屆腦血管病學術修訂的診斷標準；男20 例、女9 例；年齡40～75 歲，平均52±9 歲。頭顱MRI 檢查示新發腦梗死；入院后抽取次日早晨空腹外周血。 選取29 名門診體檢健康者作對照，其中男20 例、 女9 例； 年齡38～78 歲， 平均55±7歲。

1.2 檢測材料

儀器： 流式細胞儀， 美國Bekeman-Coulter FC500； 離心機， 美國Bekeman-Coulter ALLERGAX -12R。

試劑： 熒光標記單克隆抗體CD3-PC5/CD4-FITC/CD8-PE，批號IM1650；CD3-FITC/CD（16+56）-PE，批號A07735；CD5-FITC，批號A07753；CD19-PE， 批號IM1284U。 全血溶血試劑：OPTILYSE C。

注： 異硫氰酸熒光素 （fluorescein isothiocyanate，FITC）——綠色熒光；藻紅蛋白（P-phycoerythrin，PE）——橙色熒光； 藻紅蛋白-CY5 耦聯物（PE-CY5，PC5）——紅色熒光。

1.3 檢測方法

流式細胞術 （FCM） 檢測T%、Th%、Ts%、NK%、B1%和B2%。 測定前以標準熒光微球校正儀器調整電壓和顏色補償。 操作方法：靜脈血1～2ml EDTA 抗凝，混勻；取100μl 全血加入型號為12mm×75mm 試管中，加50μl 相應的熒光標記單克隆抗體，避光孵育20min；裂解紅細胞：試管中加Optilyse C 500μl 震蕩，室溫孵育15min；洗滌：加入稀釋液約2.5ml 混勻，1500r/min 離心5min，棄上清，加少許稀釋液（0.5ml）。然后上機檢測。記錄數據。

1.4 統計學方法

采用SPSS19.0 軟件對數據進行統計學分析，組間比較采用配對t檢驗。

2 結果

2.1 疾病組與對照組T 淋巴細胞亞群的檢測結果

疾病組和對照組基線資料均無統計學差異（均P＞0.05），樣本符合正態分布，具有可比性。 表1 示，與正常對照組相比，疾病組CD3+（T）%水平降低，差異無統計學意義（P＞0.05），CD8+（Ts）%水平顯著降低（P＜0.05）；CD4+（Th）%和Th/Ts 水平均顯著升高（均P＜0.05）。

2.2 疾病組與對照組NK 細胞和B 淋巴細胞亞群的檢測結果比較

表2 示，與正常對照組相比，疾病組NK%水平顯著降低（P＜0.05）；B1%水平升高，差異無統計學意義（P＞0.05）；B2%水平顯著升高（P＜0.05）。

表1 疾病組與對照組T 淋巴細胞亞群的檢測結果比較

表2 疾病組與對照組NK 細胞和B 淋巴細胞亞群的檢測結果比較

3 討論

3.1 ACI 與T 淋巴細胞

ACI 引發細胞免疫功能紊亂的機理尚不清楚。 1979 年CzlonkowskaA 等[1]發現ACI 外周血淋巴細胞總數減少，T 淋巴細胞同時減少，并認為與應激有關。 Berczi[2]認為腦梗死引起下丘腦-垂體-腎上腺軸功能活動增強， 產生大量的腎上腺皮質激素，使CD3+T、CD4+T 淋巴細胞數下降，從而抑制了機體免疫力。Fiorina[3]觀察到腦梗死患者與血漿褪黑素（MT）水平的降低有關，與腎上腺皮質激素水平無關。 Gendron[4]報道左右大腦皮質的不同部位的損害在免疫反應中發揮的作用不同， 同時對淋巴細胞的變化進行了進一步的分類。 Campanella M 等[5]運用流式細胞術腦梗死小腦組織進行細胞分離后檢測發現淋巴細胞顯著增加， 進一步說明外周血T 淋巴細胞的減少可能是由于大量進入中樞所致。 本研究的實驗數據可以看出，Th%、Th/Ts 的均值較正常對照組高；T%和Ts%的均值較正常對照低。Th%、Ts%、Th/Ts 的結果具有統計學意義。初發性ACI患者T%的值較正常對照值偏低，這與國內外所有的報道一致。 但是Th%、Ts%和Th/Ts 的結果與部分報道[7～9]不一致，可能與腦梗死檢測的不同時期有關。 T 淋巴細胞對機體免疫功能起著重要的調節作用， 尤其是輔助性T 細胞（Th）和抑制性T 細胞（Ts）之間的相互協調，產生適度的免疫應答，同時維持機體自身的免疫耐受。 本實驗以CD3、CD4 及CD8 這3 個T 細胞表面分子的表達為依據， 劃分Th 和Ts 細胞。CD3+為總T 淋巴細胞， 它可分為2 個主要亞群，CD4+和CD8+細胞。CD4+為輔助/誘導（Th/Ts），具有輔助效應T 細胞活化、介導B 細胞抗體生成和活化巨噬細胞等功能；CD8+為抑制殺傷細胞， 具有抑制T 細胞活化，抑制抗體產生和產生細胞毒等作用。 T 淋巴細胞亞群中Th 和Ts 細胞對免疫反應起調控作用，相互誘導、相互制約形成的細胞網絡對調控和維持免疫反應穩定起重要作用， 以免發生過度反應損傷機體[10]。 當T 淋巴細胞亞群的數量和功能發生異常時， 機體可產生免疫紊亂而導致機體發病。 通過檢測T 淋巴細胞亞群的變化，可以輔助判斷ACI 患者的免疫狀態，用于指導治療和判斷預后。

3.2 ACI 與NK 細胞

NK 細胞 （自然殺傷細胞） 介導天然免疫應答，它不依賴抗體和補體，即能直接殺傷靶細胞，如腫瘤細胞或受病毒感染的細胞等；此外，尚有免疫調節功能， 也參與移植排斥反應和某些自身免疫病的發生發展。 NK 細胞作用于靶細胞后殺傷作用出現早，體內4h 即可見到殺傷效應。 NK 細胞的靶細胞主要有某些腫瘤細胞 （包括部分細胞系）、病毒感染細胞、某些自身組織細胞（如血細胞）、寄生蟲等，因此NK 細胞是機體抗腫瘤、抗感染的重要免疫因素。 在ACI 患者中，NK 細胞的含量顯著減少（P<0.05），說明腦梗死患者體內產生了自然殺傷作用或者免疫調節功能， 具體的意義還沒有相關的文獻報道。

3.3 ACI 與B 淋巴細胞

Urra 等[6]研究認為腦梗死后可出現中樞神經系統調節的免疫抑制綜合征， 中樞神經系統與免疫系統通過神經通路相互聯系， 體液與細胞通過細胞因子相互聯系。 李娟等[11]研究發現，ACI 中B淋巴細胞數增多，B 淋巴細胞主要是通過分泌細胞因子和免疫球蛋白參加免疫反應。 B1 細胞為T細胞非依賴性細胞，B2 為T 細胞依賴性細胞。 B細胞在體內存活的時間較短，僅數天至數周，但其記憶細胞在體內可長期存在。 成熟B 細胞接受抗原刺激后， 在抗原提呈細胞和Th 細胞的輔助下成為活化B 細胞，進而分化為漿細胞，合成和分泌各類免疫球蛋白。 本實驗研究的數據顯示B1%和B2%的均值較正常對照組高，這與李娟等[11]的研究結果一致。 T 細胞分泌的細胞因子刺激B 細胞增殖并產生免疫球蛋白與體液免疫有關。 此次實驗中，Th%、B1%和B2%的均值較正常對照組高，說明機體的細胞免疫和體液免疫都被激發，體液與細胞通過細胞因子相互聯系， 促炎因子與抗炎因子間的平衡不僅決定了免疫應答， 而且影響受損腦組織的轉歸和預后。

ACI 與T、B 淋巴細胞亞群和NK 細胞的關系復雜， 本實驗數據顯示T 淋巴細胞被抑制，Th/Ts比例改變，B 淋巴細胞被激活，NK 細胞發生自然殺傷作用而消耗， 對于輔助判斷機體的免疫狀態和預防感染具有指導意義。 由于收集的數據量較少，T、B 淋巴細胞亞群和NK 細胞在ACI 中的變化和作用機制還需進一步研究。

[1] Czlonkowska A，Cyrta B，Korlak J.Immunological observations on patients with acute cerebral vascular disease [J].J Neurol SCI，1979，43（3）：455-464.

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[11] 李娟，栗秀初，馮幼啟.紫外線照射自血回輸對腦梗死患者外周血淋巴細胞亞群和血漿纖維連接蛋白的影響[J].中華理療雜志，1995，8（2）：74-76.