擬南芥F-box基因At5g22700的功能初步分析＊

王利群，唐冬英，李新梅，段桂芳，吳 丹，趙小英，劉選明

(湖南大學生物學院植物基因組學與發育調控湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410082)

泛素是由76個氨基酸組成的蛋白質，這些蛋白質能夠通過泛素化途徑特異性的結合目標蛋白和賴氨酸殘基［1，2］。早期泛素化途徑需要三種酶的共同作用:E1(泛素活酶)，E2(泛素結合酶)和E3(泛素連接酶)。在擬南芥中有2個E1s，至少37個E2s和1400多E3s。在植物中，E3泛素連接酶由不同的基因編碼。E3既能通過單個亞基也能形成多亞基蛋白質復合物行使泛素化功能［3，4］。根據與 E2綁定結構域的不同，單亞基的E3可以進一步分為含有HECT結構域和RING/U-box結構域的E3，它們具有不同的泛素傳輸機制［5］。HECT類E3是一個含有350個氨基酸的蛋白質，同時包含泛素結合域和E2綁定結構域。在擬南芥基因組中，HECT是E3蛋白家族中最小的亞家族，只有七個成員［6］。含RING結構域的E3大約有477個亞家族蛋白成員。

SCF復合體是由多亞基構成的E3連接酶，是植物體內數目最多，最具特點的E3家族蛋白［7］。SCF復合體由四個亞基組成:SKP1(在擬南芥中簡稱為ASK)，Cullin1(CUL1)，F-box 蛋白和RBX1［3］。在SCF復合體中，Cullin作為支架，它的 C-末端結合RBX1，N-末端結合SKP1。反過來SKP1蛋白與F-box結構域相互作用，在F-box蛋白的N-末端形成一個完整的SCF復合體［8］。F-box蛋白C-末端含有蛋白與蛋白相互作用的結構域，包括WD-40，KELCH和LRR(富含亮氨酸的重復域)。在擬南芥中，F-box蛋白家族由超過700個基因編碼［9］，表明在植物中泛素化介導的蛋白降解這個過程是調節生長發育的重要過程。有研究報道，F-box基因參與調節植物生長和發育的各個方面，包括激素受體和信號傳導［3，10，11］，對光相關的響應［12］，花的發育［4，12］，自交不親和［4，6］，表觀遺傳調控［6］，植物發病機理及疾病控制［6］，植物逆境脅迫反應［13，14］等。例如:在番茄中，抑制SlFbf的表達，導致花粉和種子變大，表明SlFbf的能調節雄蕊發育而影響受精［15］;F-box基因FOA1參與ABA信號轉導，調節擬南芥種子萌發、氣孔開放、和根的生長［16］。

擬南芥At5g22700基因位于第五條染色體上，含有F-box，LRR和FBD結構域，是F-box蛋白家族成員，其功能未知。本研究檢測了At5g22700蛋白與ASK家族蛋白的相互作用、該基因在不同組織器官中的表達。以T-DNA插入突變體和構建的過量表達轉基因擬南芥為材料，初步分析了At5g22700基因在植物生長發育中的功能，為全面了解植物F-box基因家族功能提供生物學信息。

1 材料與方法

1.1 植物材料及生長條件

本研究所采用的擬南芥野生型為Col-4和Col-0，T-DNA插入突變體salk060937和salk009942是從擬南芥生物資源中心(Arabidopsis Biological Resource Center，ABRC)購買的，其遺傳背景為Col-0。將植物種在長日照條件下，溫度為22±4℃。在植物生長的成年期取根、莖、葉、花和果莢，立即放入液氮，－80℃保存備用。

1.2 方法

1.2.1 T-DNA插入突變體鑒定 取T-DNA插入突變體salk060937和salk009942植物葉片，提取基因組DNA，然后采用“三引物法”即采用三個引物(LP:T-DNA插入點左邊界引物;RP:插入點右邊界引物;R0為Signal提供的一條位于T-DNA插入序列左邊界用于鑒定的引物)進行PCR擴增。以基PCR程序為:94℃ 5 min，94℃ 30 s，58℃ 30 s，72 ℃1 min，30個循環，后延伸5 min。PCR產物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳分析。引物序列為:salk060937-LP5'-GAGAATGAGGCAGTGCTCAAG-3;salk060937-RP5'-ATGCATCACCTTGAGATTTGG-3';salk009942-LP 5'-TCACCGGTTCT AATGGAACAG-3';salk009942-RP5'-AGTGCCAAAGTGTTTGCAATC-3';R05'-ATTTTGCCGATTTCGGAAC-3'。

1.2.2 RNA表達分析 采用 RNAeasy Mini Kit(TaKaRa)試劑盒提取總RNA，然后用Maxima? First Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)試劑盒合成cDNA。將cDNA稀釋10倍后用于RT-PCR及實時熒光定量PCR分析。

半定量 RT-PCR分析:取2 μL稀釋的 cDNA在20 μL的反應體系中進行PCR反應，程序為:95℃預變性5 min，95 ℃ 變性 30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，循環35次。PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳分析。持家基因ACTIN2的PCR產物作為內標，實驗重復3次。PCR引物序列為:At5g22700-RT-F 5'-TACATTCGTCAGTTTCGCCTCT-3';At5g22700-RT-R 5'-CCTAGAGCGCACCCGTAA-3';ACTIN2-RT-F 5'-CACTGTGCCAATCTACGAGGG T-3';ACTIN2-RT-R 5'-CACAAACGAGGGCTGGAA-CAAG-3'。

實時熒光定量PCR:采用SYBR? Green I試劑盒(東盛公司)，取1 μL稀釋10倍的 cDNA作為模板，在 Mx3000P(Stratagene)定量 PCR儀中進行反應。PCR擴增程序為:95℃ 10 min;95℃ 30 s;55℃30 s;72℃ 30 s;45個循環。以ACTIN2為內參，實驗重復3次。定量 PCR引物為序列為:At5g22700-QF 5'-AGCGTTATGTGATGAAAGTAGCA-3'，At5g22700-QR 5'-CGCAGTCCACGAACCTCTAT-3'。ACTIN2-QF:5'-CACTGTGCCAATCTACGAGGG T-3'ACTIN2-QR 5'-CACAAACGAGGGCTGGAACA AG-3'。

1.2.3 At5g22700基因植物表達載體及酵母表達載體構建 以野生型擬南芥cDNA為模板，進行Gateway克隆擴增。利用primer5軟件設計特異性引物:At5g22700-F:5'-CAAAAAAGCAGGCTTCATGAGCAACCGAGGAGATAGG-3'和At5g22700-R:5'-CAAGAAAGCTGGGTCTATATCCAAGACAGGGGTTGAAA-3'，以 及 At5g22700N48-F:5'-CAAAAAAGCAGGCTTCATGAGCAACCGAGGAGATAGG-3'和At5g22700 N48-R:5'-CAAGAAAGCTGGGTCTATATCCAAGACAGGG GTTGAAA-3'(下劃線序列為attB位點)，分別用于克隆At5g22700基因的CDS序列和F-box結構域。利用prime STAR高保真酶(TaKaRa)，通過PCR反應獲得帶有attB位點的PCR產物。PCR產物經瓊脂糖凝聚電泳回收目的條帶，利用BP ClonaseⅡ(invitrogen)經BP重組反應將其克隆到入門載體pDONR/ZEO。測序正確后，利用LR ClonaseⅡ(invitrogen)將At5g22700基因的CDS序列克隆到植物表達載體pEarleyGate 203(N-Myc)中，將F-box結構域片段克隆到酵母表達載體pDEST32中，獲得重組質 粒 pEarleyGate203-At5g22700和 pDEST32-At5g22700N48分別用于植物轉化和酵母雙雜交分析。

將獲得的pEarleyGate 203-At5g22700重組質粒經電擊轉入農桿菌GV3101中，然后采用浸花蕾的方法［17］轉化擬南芥。轉基因擬南芥經除草劑Basta篩選獲得純合子。收集純合子株系的葉片，液氮速凍后，于-80℃保存用于RNA提取和基因表達分析。

1.2.4 酵母雙雜交及X-Gal顯色 參照PT3024-1手冊，將獲得的重組質粒pDEST32-At5g22700N48(編碼At5g22700和GAL4 DNA綁定域的融合蛋白)，將其轉入Y187酵母中，隨后與實驗室現有的 pDEST22-ASK(ASK1，2，3，4，5，6，7，8，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，21)酵母庫 AH109 進行融合培養，然后涂布在含SD/-Leu/-Try的固體培養基上，28℃培養2-3天。挑取2-3個克隆混勻后涂布在含SD/-Leu/-Try/-His的固體培養基上，篩選與At5g22700N48蛋白相互作用的ASK蛋白。隨后用濾紙印跡顯色法檢測檢測長出的菌落的β-半乳糖苷酶活性，從而確定At5g22700N48與ASK蛋白的相互作用。Z buffer/X-Gal顯色液為:100 mL Z buffer，0.27 mL β-mercaptoethanol，1.67 mL 20 mg/mL X-gal solution。Z buffer溶液為:Na2HPO47H2O 16.1 g/L，NaH2PO4H2O 5.50 g/L，KCl 0.75 g/L，MgSO47H2O 0.246 g/L，pH 7.0。

1.2.5 擬南芥根長度測定 擬南芥種子經1%次氯酸鈉浸泡10 min，無菌水沖洗5次后，懸浮于0.1%的瓊脂糖溶液中，然后播種于MS培養基中，分別放置在黑暗、藍光(80 μmol m-2s-1)、紅光(50 μmol m-2s-1)、遠紅光(10 μmol m-2s-1)下培養7 天，對幼苗進行拍照，并測量至少20株幼苗主根的長度進行顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 At5g22700蛋白的F-box結構域與ASK蛋白家族成員的相互作用分析

利用NCBI網站提供的連接Proteins Conserved Domain Search(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)，對 At5g22700蛋白的氨基酸序列進行預測，發現該蛋白的 N端存在一個F-box結構域，C端具有一個可能參與蛋白相互作用的LRR結構域，以及可能具有轉錄因子活性的FBD結構域(圖1A)，表明At5g22700是F-box蛋白家族的一個成員。

為確認F-box蛋白At5g22700是否為SCF復合物成員，采用酵母雙雜交檢測了At5g22700蛋白的F-box結構域與擬南芥ASK家族成員的相互作用。首先，以擬南芥野生型cDNA為模板，通過PCR克隆得到F-box結構域，即At5g22700N48編碼序列片段。采用Gateway技術將At5g22700N48片段克隆到 pDEST32載體中與BD形成融合蛋白，并轉入酵母Y187中。將該酵母與轉入pDEST22-ASK酵母庫AH109進行融合培養1天后，分別涂布在含有不同濃度3-AT的SD/-Leu/-Try/-His固體培養基上。酵母雙雜交結果顯示，pDEST32-At5g22700N48和pD-EST22-ASK4共培養酵母在含不同濃度3-AT的SD/-Leu/-Try/-His培養基上均能夠繼續生長，其他酵母的生長明顯受到抑制(圖1B)，初步說明At5g22700N48與ASK4有相互作用。

為了進一步驗證At5g22700 N48與ASK4的相互作用，采用X-Gal顯色實驗進行分析。濾紙顯色結果顯示，pDEST32-At5g22700N48和 pDEST22-ASK4共培養酵母在加Z buffer/X-Gal顯色液后2小時變藍，陰性對照則沒有變藍(圖1C)，表明At5g22700蛋白的F-box結構域與ASK4存在相互作用。因此，推測At5g22700可能是SCF復合物的成員。

圖1 At5g22700蛋白F-box結構域At5g22700N48與ASK蛋白家族成員相互作用的酵母雙雜交分析Fig.1 Yeast two-hybrid analysis of interaction between At5g22700N48and ASK protein family

2.2 At5g22700基因在擬南芥不同組織器官中的表達分析

基因的組織器官表達特異性為預測和研究其生物學功能提供參考信息。為研究該基因在不同組織器官的表達情況，收集野生型擬南芥成熟植株的根、莖、蓮座葉、莖生葉、花及果莢，進行實時熒光定量PCR分析。從圖2中可看出，該基因在擬南芥各個組織器官中均有表達，其中根和花中的表達量相對較高，莖中的表達量較低，說明該基因可能在根和花的生長發育過程中起作用。

2.3 At5g22700基因T-DNA插入突變體及轉基因株系分子鑒定

圖2 At5g22700基因在擬南芥不同組織器官中表達的實時定量PCR分析Fig.2 Real time PCR analysis for At5g22700 gene expression in different organs in Arabidopsis

為了進一步分析At5g22700基因的生物學功能，從ABRC購買T-DNA插入突變體salk060937和salk009942。T-DNA插入位點分別在基因起始密碼子的下游500 bp和1891 bp的外顯子中(圖3 A)。采用三引物法對T-DNA突變體進行PCR鑒定，結果顯示株系 salk060937-1、salk060937-2、salk009942-1、salk009942-2、salk009942-3都為純合子(圖3B)。隨后，采用RT-PCR和實時熒光定量PCR分析了salk060937-1和salk009942-1株系中At5g22700基因的表達量。從圖3中可看出，該基因在突變體中的表達量明顯降低 (圖2C，D)，說明T-DNA插入破壞了At5g22700基因的正常表達，可用于隨后的表型分析實驗。

此外，我們將At5g22700基因的CDS序列克隆到植物表達載體pEarleyGate 203中，獲得pEarleyGate 203-At5g22700重組質粒，通過植物轉化和Basta篩選獲得了At5g22700轉基因純合子植株。實時熒光定量PCR分析結果顯示，At5g22700ox-1和At5g22700ox-2轉基因植株體內At5g22700基因的mRNA表達水平明顯升高，分別為野生型中的80倍和160倍，表明這兩個株系均為At5g22700過量表達轉基因株系。

2.4 At5g22700過量表達或者缺失表達對擬南芥幼苗主根伸長的影響

根據上述組織器官表達結果，我們推測At5g22700可能參與植物根和花的發育。因此以At5g22700過量表達轉基因擬南芥及T-DNA插入突變體為材料，分析了At5g22700的功能。首先，將擬南芥播種在土壤中，培養在長日照條件下觀察開花時間及花的形態，結果發現這些植株并沒有表現出特異表型。隨后，將擬南芥種子播種在MS固體培養基上，放置在黑暗、藍光、紅光或者遠紅光條件下進行培養。經表型觀察和統計分析，發現藍光下At5g22700過量表達突變體的主根比野生型長，黑暗、白光、紅光和遠紅光條件下主根長度與野生型之間無明顯差異(圖4)，說明該基因過量表達導致幼苗的下根變長，并且具有藍光特異性。但是，所有光照條件下，T-DNA插入突變體的根與野生型之間無差異，這說明該基因與同源基因之間可能存在功能冗余現象，這還有待于進一步研究。

圖3 T-DNA插入突變體及過量表達轉基因株系的分子鑒定Fig.3 Molecular Identification of T-DNA insertion mutants and transgenic lines

3 討論

F-box蛋白通常通過其F-box結構域與Skp1(在擬南芥中簡稱為ASK)相互作用，與Cullin、RBX1共同構成SCF復合物。在擬南芥中存在21個ASK基因家族成員［18］，F-box蛋白可能與其中1個或者多個ASK相互作用［19］，如 F-box蛋白 DOR與 ASK4相互作用［20］，EDL3 與 5個 ASK 蛋白包括 ASK1、ASK2、ASK4、ASK11 和 ASK18 相互作用［21］，COI1(CORONATINE INSENSITIVE1)與 ASK1 相 互 作 用［22］，At3g16740與ASK11相互作用［23］。在本研究中，通過酵母雙雜交實驗發現At5g22700蛋白的F-box結構域與ASK4具有較強的相互作用(圖1B，C)，但是At5g22700全蛋白與本實驗中所用的16個ASK蛋白家族成員間無相互作用(圖片沒有列出)，這可能是由于At5g2700全蛋白在酵母中形成的空間結構阻礙了F-box結構域與ASK4蛋白的結合。At5g2700蛋白在植物中是否與ASK4相互作用還需進一步研究。

圖4 不同光照條件下At5g22700過量表達或者缺失表達擬南芥幼苗的表型分析Fig.4 Root Phenotype of At5g22700-overexpressing plant and T-DNA insertion mutant in different light condition

通過分析基因在植物不同組織器官的表達可為預測基因的功能提供線索［24］。本研究發現該基因在擬南芥各個組織器官中都有表達，其中根和花中的表達最高，推測該基因可能參與植物花和根的發育調控。At5g2700過量或者缺失表達對開花無影響，但是過量表達導致擬南芥幼苗根變長，缺失表達對根的伸長則無影響，說明該基因調控擬南芥主根伸長，并可能存在功能冗余現象。

本研究中最有趣的現象是，At5g2700對幼苗根伸長的促進作用具有藍光特異性。有研究報導在擬南芥中，藍光受體cry1和cry2調節主根的生長［25］，表明At5g2700可能通過藍光信號途徑調節根的伸長，這種假設還需要進一步的研究。

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