產蛋白酶混合菌系對堿性剩余污泥水解酸化的影響

接偉光，彭永臻（1.城市水資源與水環境國家重點實驗室（哈爾濱工業大學），150090哈爾濱；2.黑龍江東方學院食品與環境工程學部，150086哈爾濱；3.北京市水質科學與水環境恢復工程重點實驗室（北京工業大學），100124北京）

產蛋白酶混合菌系對堿性剩余污泥水解酸化的影響

接偉光1，2，彭永臻1，3
（1.城市水資源與水環境國家重點實驗室（哈爾濱工業大學），150090哈爾濱；2.黑龍江東方學院食品與環境工程學部，150086哈爾濱；3.北京市水質科學與水環境恢復工程重點實驗室（北京工業大學），100124北京）

為提高剩余污泥水解酸化過程中揮發性脂肪酸（VFAs）的累積，從剩余污泥中分離產蛋白酶活力較高的耐堿細菌，并構建產蛋白酶混合菌系.將其接種于堿性（pH 10.0）發酵剩余污泥的不同發酵時期，評價其對溶解性有機化合物和VFAs累積的影響，探討利用剩余污泥生產VFAs的最佳條件.從剩余污泥中分離到2株產蛋白酶活力較高的耐堿細菌，并構建產蛋白酶混合菌系.在發酵初期接種混合菌系效果最顯著，且可縮短發酵啟動時間2 d.發酵初期接種混合菌系后，溶解性蛋白質和VFAs質量濃度在第8天均達到最高值，分別為未接種混合菌系樣品中相應值的1.25和1.41倍，分別占溶解性化學需氧量（SCOD）總量的29.87%和44.54%.乙酸和丙酸為剩余污泥水解酸化過程中VFAs的主要組分，分別占VFAs總量的50.69%和18.19%.

剩余污泥；水解酸化；混合菌系；內碳源；揮發性脂肪酸

活性污泥法能夠有效地處理各種類型的污水，但會產生大量的剩余污泥［1］.剩余污泥中含有大量的有機或無機污染物及病原體，處置不當會污染環境并影響人類健康［2］.此外，剩余污泥的處理費用約占污水處理廠運行成本的60%［3］.因此，采用適當方法對污泥進行處理和處置成為污水處理廠的首要任務［4］.目前，剩余污泥的處理及處置方法多種多樣，如焚燒、填埋、海洋傾棄等［5-6］.然而這些方法均會對環境產生負面影響.生物營養物質（氮和磷）的去除是減輕水體富營養化的一種有效途徑.污水中易于生物降解的有機物，如揮發性脂肪酸（volatile fatty acids，VFAs）顯著影響著生物營養物的去除效率.然而，污水中VFAs質量濃度往往較低.污水生物處理時如人為添加外碳源，會在一定程度上增加運營成本.近年的研究表明，污泥發酵產生的VFAs既可作為生物營養物去除的內碳源，又可起到污泥減量的作用，從而降低運營成本［7-8］.

污泥厭氧消化包括水解、酸化和產甲烷3個階段.水解反應通常被認為是污泥厭氧消化的限速步驟，該反應產生的VFAs可被產甲烷菌利用［9］.為了降低水解階段的影響，各種預處理方法已應用于加速污泥水解或改善污泥厭氧消化工藝［10-11］.蛋白質和碳水化合物是剩余污泥中的主要有機物，在剩余污泥酸化階段可以被轉化為VFAs，且乙酸和丙酸是污水處理廠用于脫氮除磷工藝優選的有機碳源［12-14］.近年的研究表明，污泥厭氧發酵過程中pH及污泥中微生物群落結構顯著影響VFAs的產量及組分［4，14-15］.然而，關于接種微生物對剩余污泥水解酸化過程中VFAs產量影響的研究卻鮮有報道.本研究從剩余污泥中分離產蛋白酶活力較高的耐堿細菌，并構建產蛋白酶混合菌系.將該混合菌系接種于堿性（pH 10.0）發酵剩余污泥的不同時期，評價其在堿性條件下對溶解性化學需氧量（SCOD）、溶解性蛋白質和碳水化合物、VFAs等的影響，探討利用剩余污泥生產VFAs的最佳條件.同時有助于了解VFAs積累的機制，有益于剩余污泥的資源化利用.

1 實 驗

1.1 污泥來源

實驗所用剩余污泥均取自哈爾濱太平污水處理廠二沉池.污泥取回后靜置24 h，棄上清液，于4℃保存備用.濃縮后的剩余污泥pH為6.82，總固體（TS）質量濃度為13.68 g／L，揮發性固體（VS）質量濃度為10.36 g／L，SCOD為142.21 mg／L，溶解性蛋白質質量濃度為76.32 mg／L，溶解性碳水化合物為30.87 mg／L.

1.2 培養基

基礎培養基：10 g脫脂奶粉，3 g酵母提取物，0.5 g氯化鈉，6.7 g硫酸銨，0.5 g硫酸鎂，0.7 g磷酸二氫鉀，1.2 g磷酸氫二鉀，1 L蒸餾水，pH 10.0，121℃滅菌20 min.

透明圈培養基：10 g脫脂奶粉，5 g蛋白胨，2.5 g酵母提取物，10 g可溶性淀粉，0.5 g磷酸二氫鉀，0.5 g硫酸鎂，1 g氯化鈉，20 g瓊脂，1 L蒸餾水，pH 10.0，121℃滅菌20 min.

產酶液體培養基：40 g葡萄糖，20 g蛋白胨，1.4 g磷酸氫二鈉，0.6 g氯化鈣，0.4 g硫酸鎂，1 L蒸餾水，pH 7.0～7.2，121℃滅菌20 min.

LB培養基：10 g胰蛋白酶胨，5 g酵母提取物，5 g氯化鈉，1 L蒸餾水，pH 7.0～7.2，121℃滅菌20 min.

1.3 菌株的分離鑒定及蛋白酶活力的測定

將1 g剩余污泥接種于250 mL基礎培養基中，120 r／min、30℃厭氧培養48 h.將培養液適當稀釋后涂布于瓊脂基礎培養基中，30℃厭氧培養48 h.挑選長勢良好的單菌落，并重復以上步驟直至獲得純培養.將初篩獲得的菌株分別涂布于透明圈培養基中，30℃厭氧培養48 h，挑取水解圈直徑與菌落直徑比值較大的單菌落，并分別接種于不同條件下的產酶液體培養基中，厭氧培養48 h后，采用Folin試劑顯色法測定其酶活力［16］. pH 10.0、30℃條件下，以1 mL酶液每分鐘水解酪蛋白產生1μg酪氨酸所需酶量定義為1個酶活力單位.將分離獲得的產蛋白酶活力較高的菌種進行鑒定，具體方法見文獻［17］.測序得到的16S rDNA序列提交至GenBank數據庫，并通過NCBI的BLASTN程序對測序結果進行同源性分析，獲得相關種屬的序列信息，采用MEGA5.1軟件進行系統發育分析.

1.4 混合菌系的構建

將分離到的菌株分別接種于250 mL LB培養基中，120 r／min、30℃厭氧培養12 h后，調節培養基pH至10.0，120 r／min、30℃繼續厭氧培養36 h，使菌株能夠在接種污泥后快速適應堿性發酵條件.發酵液分別以6 000 r／min離心10 min，棄上清液，菌體沉淀用無菌水洗滌并離心2次.以無菌水分別將各菌體質量濃度調節至OD600為0.8，并將其1∶1混勻后作為接種物，即混合菌系.

1.5 序批實驗

本研究采用序批式發酵，用2mol／L的NaOH溶液將3.5 L剩余污泥調節pH至10.0后，平均分配到0～4號反應瓶（1 L錐形瓶）中，保證污泥性質、質量濃度及顆粒大小一致.1～4號反應瓶分別在剩余污泥水解酸化第0天、5天、10天和15天將混合菌系以5%的接種量進行添加.0號反應瓶為對照，添加與接種量一致的無菌水，以保證污泥質量濃度一致.每種處理3個平行重復，100 r／min、30℃振蕩器內發酵20 d.使用2mol／L的NaOH溶液調節pH，每6 h調節各反應瓶內pH 1次，保證pH穩定在10.0±0.3.每48 h取各反應瓶中發酵污泥10 mL，10 000 r／min離心后立即用細菌濾器過濾，測定上清液中SCOD、溶解性蛋白質、溶解性碳水化合物和VFAs等指標.實驗前及每次調節pH或取樣后，各反應瓶均通入氮氣5 min以保證驅除瓶內氧氣，并用橡膠塞密封.

1.6 分析方法

SCOD按照標準方法測定［18］；溶解性蛋白質質量濃度的測定采用國家標準方法［19］；溶解性碳水化合物采用苯酚-硫酸法測定［20］；VFAs質量濃度的測定采用氣相色譜法（安捷倫6890N色譜分析儀，FID檢測器）［15］.

圖1 菌株HIT-01和HIT-02 16S rDNA序列與其近緣物種的系統發育樹

2 結果與討論

2.1 菌種的分離及鑒定

從剩余污泥中共分離到17株細菌，通過初篩得到6株生長穩定的耐堿細菌，進一步復篩獲得2株產蛋白酶活力較高的耐堿細菌，分別命名為HIT-01和HIT-02.經鑒定，這2株細菌均為芽孢桿菌屬（Bacillus）細菌.在LB瓊脂培養基上生長時，菌株HIT-01形成的菌落呈淺黃色、邊緣整齊、菌落扁平、表面干燥、不易挑起.菌株HIT-02形成的菌落呈乳白色、邊緣呈鋸齒形、菌落中心微凸起、表面濕潤、易挑起.2株細菌在pH 6.0～11.0條件下均能生長.經鏡檢，2株細菌均為革蘭氏陽性芽孢桿菌.其GenBank登陸號分別為KF738663和KF738664.為顯示菌株HIT-01和HIT-02與已知細菌之間的親緣關系及其系統地位，將其16S rDNA序列在GenBank中進行同源序列比對. Blast分析結果表明，菌株HIT-01的16S rDNA序列與Bacillus subtilis（DQ993674）相似性達99%.菌株HIT-02的16S rDNA序列與Bacillus sp.（AB243843）相似性達98%.采用MEGA 5.1構建系統發育進化樹，用Neighbor-joining法對其評價.由圖1可知，菌株HIT-01與Bacillus subtilis（DQ993674）、Bacillus velezensis（EF433407）和Bacillus amyloliquefaciens（KF156785）相似性較高，聚為一簇.菌株HIT-02與GenBank中獲得的其他15個已知細菌序列相似性較高，聚為一簇.

2.2 菌株產酶狀況

2.2.1 培養溫度對菌株產酶的影響

將菌株HIT-01和HIT-02分別接入產酶液體培養基中，分別于25，30，35，40，45℃下，120 r／min厭氧培養48 h，以最高酶活力為100%，其他與之相比計算相對酶活力，研究溫度對菌體產酶的影響.由圖2可知，菌株HIT-01和HIT-02蛋白酶均在30℃時酶活力最高，溫度降低或升高酶活力反而降低.當溫度超過40℃時，蛋白酶活力急速下降.因此，最適產酶溫度均為30℃.

圖2 培養溫度對菌株產酶的影響

2.2.2 培養基初始pH對菌株產酶的影響

將菌株HIT-01和HIT-02分別接入pH為7.0，8.0，9.0，10.0，11.0的產酶液體培養基中，30℃、120 r／min厭氧培養48 h，研究pH對菌體產酶的影響.由圖3可知，培養基初始pH對菌株HIT-01和HIT-02產酶影響均較大，隨著pH的升高，蛋白酶活力逐漸升高.pH為10.0時，產酶活力均最高.隨著pH繼續升高，蛋白酶活力急劇下降.因此，最適產酶pH均為10.0.

圖3 培養基初始pH對菌株產酶的影響

2.2.3 碳源和氮源對菌株產酶的影響

分別以蔗糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉代替產酶液體培養基中的葡萄糖，以葡萄糖作對照，30℃、pH 10.0、120 r／min厭氧培養48 h，分析碳源對菌株產酶的影響.由圖4可知，不同碳源對菌株產酶的影響較大，菌株HIT-01和HIT-02均是以葡萄糖作為唯一碳源時產酶活力最高.

圖4 不同碳源對菌株產酶的影響

分別以NH4NO3、（NH4）2SO4、KNO3和酪蛋白代替產酶液體培養基中的蛋白胨，以蛋白胨作對照，30℃、pH 10.0、120 r／min厭氧培養48 h，分析氮源對菌株產酶的影響.由圖5可知，不同氮源對菌株產酶的影響也較大，菌株HIT-01和HIT-02均是以蛋白胨作為唯一氮源時產酶活力最高.

圖5 不同氮源對菌株產酶的影響

2.3 混合菌系對SCOD的影響

水解階段被認為是剩余污泥厭氧發酵的限速步驟，SCOD的變化可在一定程度上反映污泥的水解程度［21］.此外，增加污泥水解速率或減少產甲烷菌對VFAs的利用，能夠在一定程度上加速SCOD的累積［22］.由圖6可知，隨著發酵時間的增加，各反應瓶中SCOD均迅速增加，且1號反應瓶增加最明顯，在發酵第8天達到最高值（7 132.13 mg／L），隨后SCOD緩慢降低，但始終高于其他反應瓶.而0號反應瓶SCOD增加相對緩慢，在發酵第10天達到最高值，為5 268.70 mg／L，僅為1號反應瓶中SCOD最高值的0.74倍，隨后緩慢下降.此外，Lee等［23］研究表明，SCOD變化與有機物降解及微生物代謝的綜合作用有關.因此，發酵的起始階段添加混合菌系能夠加速剩余污泥水解，SCOD增加最明顯.

圖6 SCOD與發酵時間關系

2.4 混合菌系對溶解性蛋白質和碳水化合物的影響

蛋白質和碳水化合物是微生物細胞胞外聚合物的主要成分［24］，在剩余污泥水解酸化過程中，堿性作用于耐堿能力較弱的微生物細胞，可使其細胞間的絮狀結構物和胞外聚合物分解，進而成為溶解性的COD.由圖7可知，1號反應瓶中蛋白質質量濃度始終高于其他反應瓶，且在發酵前4 d質量濃度迅速增加，而后增速緩慢，在發酵第8天達到最高值（2 130.43 mg／L），占SCOD總量的29.87%，為0號反應瓶中蛋白質質量濃度最高值的1.25倍，隨后其質量濃度緩慢降低.1號反應瓶中較高的溶解性蛋白質質量濃度在一定程度上為VFAs的產生提供了物質基礎.

圖7 溶解性蛋白質的變化

由圖8可知，溶解性碳水化合物與溶解性蛋白質質量濃度變化趨勢相似.1號反應瓶中碳水化合物質量濃度始終高于其他反應瓶，在發酵的前10 d碳水化合物質量濃度增加較快，在發酵第14天達到最高值（619.77 mg／L），僅占SCOD總量的9.09%，為0號反應瓶中碳水化合物質量濃度最高值的1.31倍，隨后其質量濃度緩慢降低.此外，由圖7、8可知，溶解性蛋白質質量濃度始終明顯高于溶解性碳水化合物，這與剩余污泥中蛋白質具有較高的質量濃度相對應.

2.5 混合菌系對VFAs累積及組分的影響

由圖9可知，剩余污泥中VFAs的初始質量濃度僅為20.35mg／L，隨著發酵時間的增加，各處理中VFAs的質量濃度均經歷了一段迅速上升時期，當其質量濃度達到峰值后緩慢下降.1號反應瓶VFAs質量濃度增加速度最快，在發酵第8天達到最高值（3 176.75 mg／L），占SCOD總量的44.54%，為0號反應瓶中VFAs質量濃度最高值的1.41倍，隨后VFAs質量濃度緩慢降低，并在發酵第14天后趨于平穩.VFAs的組分也能夠在一定程度上反映污泥水解程度.對1號反應瓶中剩余污泥水解酸化產生的VFAs組分進行了分析.在剩余污泥水解酸化的整個過程中，各種揮發酸組分占VFAs總量的比例始終穩定，且乙酸所占比例最高，平均為50.69%.其次為丙酸，平均為18.19%，戊酸所占比例最低，僅為4.09%.結果表明，在剩余污泥水解酸化過程中接種混合菌系能夠提高VFAs產量，而且能夠縮短產酸發酵的啟動時間.

圖8 溶解性碳水化合物的變化

圖9 VFAs的變化

3 結 論

1）在剩余污泥中分離獲得2株耐堿且產蛋白酶活力較高的芽孢桿菌屬細菌，并構建了產蛋白酶混合菌系.

2）通過研究菌株生長特性和檢測發酵產物，確定應用該混合菌系進行剩余污泥產酸發酵的適宜條件為：發酵初期以5%的接種量添加該混合菌系后，30℃、pH 10.0條件下厭氧發酵8 d.

3）在發酵初期接種該混合菌系，可縮短發酵啟動時間2 d，SCOD、溶解性蛋白質和VFAs的質量濃度均可在發酵第8天達到最高值，且顯著高于其他反應瓶中相應值.溶解性蛋白質和VFAs分別占SCOD總量的29.87%和44.54%.

4）乙酸和丙酸為剩余污泥水解酸化過程中產生的主要短鏈揮發酸，分別占VFAs總量的50.69%和18.19%.

［1］PAVéA.By way of introduction：modelling living systems，their diversity and their complexity—some methodological and theoretical problems［J］.Comptes Rendus Biologies，2006，329（1）：3-12.

［2］LIU Z G，WANG Y P，HE N，et al.Optimization of polyhydroxybutyrate（PHB）production by excess activated sludge and microbial community analysis［J］. Journal of Hazardous Materials，2001，185（1）：8-16.

［3］WEIY S，VAN-HOUTEN R T，BORGER A R，et al. Minimization of excess sludge production for biological wastewater treatment［J］.Water Research，2003，37（18）：4453-4467.

［4］LIU H，WANG J，LIU X L，et al.Acidogenic fermentation of proteinaceous sewage sludge：effect of pH［J］.Water Research，2012，46（3）：799-807.

［5］RENOU S，GIVAUDAN JG，POULAIN S，et al.Landfill leachate treatment：review and opportunity［J］.Journal of Hazardous Materials，2008，150（3）：468-493.

［6］KHWAIRAKPAM M，BHARGAVA R.Vermitechnology for sewage sludge recycling［J］.Journal of Hazardous Materials，2009，161（2／3）：948-954.

［7］ZHANG D，CHEN Y G，ZHAO Y X，et al.New sludge pretreatmentmethod to improve methane production in waste activated sludge digestion［J］.Environmental Science＆Technology，2010，44（12）：4802-4808.

［8］TAN R，MIYANAGA K，UY D，et al.Effect of heatalkaline treatment as a pretreatmentmethod on volatile fatty acid production and protein degradation in excess sludge，pure proteins and pure cultures［J］. Bioresource Technology，2012，118：390-398.

［9］UCISIK A S，HENZE M.Biological hydrolysis and acidification of sludge under anaerobic conditions：the effect of sludge type and origin on the production and composition of volatile fatty acids［J］.Water Research，2008，42（14）：3729-3738.

［10］APPELS L，DEGRèVE J，BRUGGEN B V，et al. Influence of low temperature thermal pre-treatment on sludge solubilisation，heavy metal release and anaerobic digestion［J］.Bioresource Technology，2010，101（15）：5743-5748.

［11］RANIR U，KUMAR SA，KALIAPPAN S，et al.Low temperature thermo-chemical pretreatment of dairy waste activated sludge for anaerobic digestion process［J］. Bioresource Technology，2012，103：415-424.

［12］LUO K，YANG Q，YU J，et al.Combined effect of sodium dodecyl sulfate and enzyme on waste activated sludge hydrolysis and acidification［J］.Bioresource Technology，2011，102（14）：7103-7110.

［13］YANG X，DU M A，LEE D J，et al.Enhanced production of volatile fatty acids（VFAs）from sewage sludge byβ-cyclodextrin［J］.Bioresource Technology，2012，110：688-691.

［14］KARGI F，UYGUR A.Effect of carbon source on biological nutrient removal in a sequencing batch reactor［J］.Bioresource Technology，2003，89（1）：89-93.

［15］WU H Y，GAO J Y，YANG D H，et al.Alkaline fermentation of primary sludge for short-chain fatty acids accumulation and mechanism［J］.Chemical Engineering Journal，2010，160（1）：1-7.

［16］黃紅英，方海紅，劉愛民，等.一株地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶的研究Ⅰ［J］.微生物學通報，2001，28（5）：20-24.

［17］WEISBURGW G，BAMS SM，PELLETIER D A，et al.16S ribosomal DNA for phylogenetic study［J］. Journal of Bacteriology，1991，173（2）：697-703.

［18］水和廢水監測分析方法編委會.水和廢水監測分析方法［M］.4版.北京：中國環境科學出版社，2002.

［19］中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.GB／T23527—2009蛋白酶制劑［S］.北京：中國標準出版社，2009.

［20］HERBERT D，PHILIPPS P J，STRANGE R E. Carbohydrate analysis［J］.Methods in Enzymology，1971，5B（2）：265-277.

［21］HATZICONSTANTINOU G J，YANNAKOPOULOSP，ANDREADAKIS A.Primary sludge hydrolysis for biological nutrient removal［J］.Water Science and Technology，1996，34（1／2）：417-423.

［22］YAN Y Y，FENG L Y，ZHANG C J，et al.Ultrasonic enhancement of waste activated sludge hydrolysis and volatile fatty acids accumulation at pH 10.0［J］.Water Research，2010，44（11）：3329-3336.

［23］LEE S H，CHUNG W C，YU Y J，et al.Effect of alkaline protease-producing Exiguobacterium sp.YS1 inoculation on the solubilization and bacterial community ofwaste activated sludge［J］.Bioresource Technology，2009，100：4597-4603.

［24］LIU H，FAN H H P.Extraction of extracellular polymeric substances（EPS）of sludges［J］.Journal of Biotechnology，2002，95（3）：249-256.

（編輯 劉 彤）

Effect ofm ixed m icrobial consortium capable of protease-producing on hydrolysis and acidification of excess sludge under alkaline condition

JIEWeiguang1，2，PENG Yongzhen1，3
（1.State Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment（Harbin Institute of Technology），150090 Harbin，China；2.Dept.of Food and Environment Engineering，East University，150086 Harbin，China；3.Key Laboratory of Beijing for Water Quality Science and Water Environment Recovery Engineering（Beijing University of Technology），100124 Beijing，China）

To improve volatile fatty acids（VFAs）accumulation from hydrolysis and acidification of excess sludge（ES），alkali-tolerant bacteria capable of protease-producing were isolated from ES.A mixed microbial consortium capable of protease-producingwas constructed by the isolated bacterial strains.Themixedmicrobial consortium was inoculated into the different fermentation periods of ES to investigate their effects on soluble organic compounds and VFAs accumulation from ES under alkaline conditions（pH 10.0）.The optimal condition for VFAs accumulation from ESwas investigated.The results showed that two alkali-tolerant bacterial strains capable of protease-producing were isolated from ES and constructed as amixed microbial consortium. The soluble organic compounds concentrations and VFAs accumulation were improved significantly after the mixed microbial consortium was inoculated at the initial fermentation，and the start-up phasewas shortened by 2 days.On the 8th day of fermentation，the concentrations of soluble protein and total VFAs reached their peak values，and were 1.25 times and 1.41 times higher as compared to the corresponding values from noninoculated samples，and accounted for 29.87%and 44.54%of total SCOD concentration，respectively.Acetic and propionic acidswere themost prevalent VFAs（account for 50.69%and 18.19%，respectively）.

excess sludge（ES）；hydrolysis and acidification；mixed microbial consortium；internal carbon source；volatile fatty acids（VFAs）

X703

A

0367-6234（2014）12-0033-06

2013-12-01.

國家高技術研究發展計劃項目（2012AA063406，2011AA060903-02）.

接偉光（1981—），男，博士研究生；彭永臻（1949—），男，教授，博士生導師.

彭永臻，pyz＠bjut.edu.cn.