人參單體皂苷Rh2與順鉑聯合應用誘導小鼠前列腺癌凋亡

何靜春 李 峰 趙麗娟

(天津市第四中心醫(yī)院呼吸科一病區(qū)，天津 300141)

前列腺癌是在世界第六大常見癌癥，同時在北美和非洲一些地區(qū)前列腺癌是男性中最常見的癌癥。不同的地理區(qū)域有不同的發(fā)病率和死亡率〔1〕，吉林大學前列腺疾病防治研究中心率先在中國開展了前列腺癌集團篩查、預防和早期診治研究。通過2.3萬余人的前列腺特異性抗原(PSA)檢測結果顯示：近幾年長春市前列腺癌的發(fā)病率正呈逐漸上升趨勢〔2〕。目前對前列腺癌的治療手段之一為內分泌療法，但多數患者經治療一段時間后，其癌細胞大多由雄激素依賴性變?yōu)樾奂に胤且蕾囆?，而導致腫瘤擴散和轉移，結果使腫瘤細胞的生長無法控制而導致內分泌治療失敗。本研究擬探討Rh2單獨用藥及Rh2與順鉑聯合應用抗前列腺癌的作用，并揭示其作用機制，以期為臨床前列腺癌的預防和應用安全有效的抗癌藥物提供理論依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物 C57BL-6J小鼠購于吉林大學白求恩醫(yī)學部實驗動物中心。

1.2試劑 逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR) RNA提取試劑盒(Trizol),逆轉錄酶(MMLV-RT)，脫氧核糖核酸酶(DNase RO.1),TaqDNA,聚合酶，dNTP和DNA Ladder Marker均購于 Promega公司。免疫組化SABC 染色試劑盒及caspase-3抗體購于武漢博士德生物工程有限公司。caspase-3引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。人參單體皂苷Rh2由吉林大學天然藥物化學教研室提供。順鉑(CDDP)購于齊魯制藥廠。

1.3方法

1.3.1實驗分組 C57BL-6J雄性小鼠 40只，體重22±2 g，共分5組，每組8只。2×106個RM-1細胞(總體積0.2 ml)，接種于小鼠左季肋部，接種第三日開始給藥。①Rh2組：10 mg/kg，灌胃。②CDDP小劑量組：1 mg/kg，腹腔注射。③CDDP大劑量組：2 mg/kg，腹腔注射。④Rh2+CDDP小劑量組：Rh210 mg/kg灌胃，CDDP1 mg/kg，腹腔注射。⑤模型對照組。1次/d，連續(xù)給藥15 d。停藥次日，脫頸處死小鼠，剝離瘤塊，稱取瘤重，計算抑瘤率。

1.3.2RT-PCR檢測前列腺癌組織caspase-3 mRNA的表達 引物采用分子生物學分析軟件Primer 設計，caspase-3的引物序列:上游5′-ACTGGAATGTCATCTCGCTCTG -3′,下游5′-CCA CGACCCGTCCTTTGA-3′,擴增片段長度為468 bp;β-actin的引物序列:上游5′-TTGTTACCAACTGGGACG-3′,下游5′-GGCATAGAGGTCTTTACGG-3′,擴增片段長度為600 bp。

1.3.3RNA提取 將小鼠斷髓處死，迅速分離腫瘤，按Trizol液的說明書提取前列腺癌組織。參照Promega公司逆轉錄試劑盒合成cDNA，總反應體系20 μl，42℃反應1 h，70℃反應10 min，4℃反應5 min，cDNA產物置于-20℃保存。取2 μl逆轉錄反應液進行PCR擴增，反應條件為94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，擴增30個循環(huán)，產物-20℃保存。取PCR產物4 μl經1.2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外觀察、拍照并用光密度儀掃描分析,β-actin吸光密度值進行標準校正，計算caspase-3 mRNA表達的相對值。

2 結 果

2.1Rh2、CDDP對C57BL-6J小鼠的抑瘤率的影響 前列腺癌小鼠模型建立14 d后，模型組所有的小鼠腫瘤生長迅速，小鼠行動受限；Rh2給藥組小鼠腫瘤生長較慢，小鼠行動較自由，未見明顯異常體征，說明藥物未出現明顯毒副作用。統計分析表明，Rh2組、CDDP大劑量組、CDDP小劑量組，Rh2+CDDP小劑量組的腫瘤重量顯著低于模型組，給藥各組抑瘤率均大于30%(見表1)。Rh2+CDDP小劑量組瘤重明顯低于單獨CDDP小劑量組，說明Rh2與CDDP聯合應用有協同的抑瘤作用。

2.2Rh2、CDDP對C57BL-6J小鼠的體重的影響 見表1，CDDP小劑量組、CDDP大劑量組，Rh2+CDDP小劑量組小鼠體重明顯下降，與模型組比較差異顯著(P<0.01)。Rh2組小鼠體重與模型組比較無統計學意義(P>0.05)。

2.3Rh2、CDDP對前列腺癌組織內caspase-3 mRNA表達的影響 瓊脂糖凝膠電泳可見 caspase-3和β-actin兩條帶分別為435 bp和600 bp。前列腺癌組織中caspase-3 mRNA表達檢測表明：給藥各組caspase-3 mRNA的含量與內參基因β-actin mRNA含量比值(0.91，1.34，1.37，1.02)明顯高于模型組(0.56)。見圖1。

2.4Rh2、CDDP對前列腺癌組織caspase-3蛋白表達的影響 典型caspase-3基因表達陽性細胞，均為細胞質著色，呈黃褐或黃色，不均勻散在分布，治療組的caspase-3基因表達情況明顯高于模型組。bcl-2基因的陰性表達細胞質呈黃褐色，治療組前列腺癌組織胞質著色細胞表達減少。見圖2。

表1 Rh2、CDDP對C57BL-6J小鼠體重、瘤重的影響

M：Marker,1～5:模型組，CDDP小劑量組，CDDP大劑量組，Rh2+CDPP小劑量，Rh2組

圖2 Rh2、CDDP對前列腺癌組織caspase-3蛋白表達

3 討 論

細胞增殖與凋亡失敗決定著腫瘤增長的速度，其中比較重要的因素就是細胞周期的調控細胞被阻止在G1/S期。在臨床腫瘤聯合化療中順鉑用藥頻度較大〔3〕，為了盡可能降低其毒副作用，國內外一直在探索順鉑的安全用藥模式，但未取得顯著進展〔4〕。目前已發(fā)現人參單體皂苷Rh2對體外人肝癌細胞SK-HEP-1的生長具有抑制作用，且對前列腺癌PC-3M細胞也有明顯的抗腫瘤效應〔5〕。caspase家族是細胞凋亡調控的關鍵分子群，其中caspase-3被證實處于該級聯反應的下游，為凋亡執(zhí)行基因，在凋亡過程中起著重要作用〔6〕。

本研究說明Rh2與小劑量CDDP聯合無增加其毒副作用，明顯低于大劑量CDDP組的毒副作用。Rh2具有與化療藥物CDDP相同的抑制腫瘤生長作用。其中Rh2與小劑量CDDP聯合應用，抑瘤作用明顯高于單純小劑量CDDP的作用效果，其腫瘤抑制率與大劑量CDDP相近，說明Rh2可以在體內協同CDDP的抗腫瘤作用。Rh2與CDDP能協同進一步促進caspase-3蛋白表達。

總之，Rh2聯合小劑量CDDP組能減少單獨大劑量CDDP抗小鼠前列腺癌帶來的毒副作用，卻能夠協同顯著提高抗小鼠前列腺癌細胞的效果。

4 參考文獻

1Martínez-Salamanca JI,Martínez Ballesteros C，Carballido Rodríguez J.Epidemiological fundamentals of clinically localized prostate cancer〔J〕.Arch Esp Urol，2011;64(8):703-10.

2張 靈,計國義,趙雪儉.前列腺癌集團檢診對臨床前列腺癌診斷的影響〔J〕.中華泌尿外科雜志,2004；25(2):103-6.

3Chi-Chih Cheng，Shu-Mei Yang.Molecular mechanisms of ginsenoside Rh2- mediated G1growth arrest and apoptosis in human lung adenocarcinoma A549 cells〔J〕.Cancer Chemother Pharmacol，2005;55(6):531-40.

4Kobayashi M，Wood PA，Hrushesky WJ.Circadian chemotherapy for gynecological and genitourinary cancers〔J〕.Chronobiol Int，2002；19(1)：237-40.

5周桂華，孟 艷.人參單體皂苷Rh2對體外培養(yǎng)的前列腺癌細胞株PC-3M抑制效應的研究〔J〕.白求恩醫(yī)科大學學報，2001；6(27)：595-7.

6Denault JB，Eckelman BP，Shin H，etal.Caspase 3 attenuates XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis protein)-mediated inhibition of caspase 9〔J〕. Biochem J，2007；405(1)：11-9.