四跨膜蛋白CD151在胃癌組織中表達的臨床意義

翁文霞，張金金，黃幼生，薛逢貴，羅志飛，佘梓宏，解娜

（海南醫學院病理教研室海南醫學院附屬醫院病理科，海南海口570102）

·臨床病理·

四跨膜蛋白CD151在胃癌組織中表達的臨床意義

翁文霞，張金金，黃幼生，薛逢貴，羅志飛，佘梓宏，解娜

（海南醫學院病理教研室海南醫學院附屬醫院病理科，海南海口570102）

目的 探討四跨膜蛋白CD151過表達與胃癌進展的關系。方法收集胃癌組織蠟塊及手術標本，應用免疫組化SP法及RT-PCR的方法檢測CD151在胃癌組織中的表達情況。結果CD151在胃癌組織、腸化生、修復性胃黏膜上皮中表達；CD151在腸型胃癌組織中的表達明顯高于彌漫型胃癌(28/52 vs 25/71，P=0.045)；在發生轉移的胃癌組織中，CD151的表達強度高于未發生轉移的胃癌組織(12/42 vs 41/81，P=0.022)；在Ⅲ、Ⅳ期胃癌組織中的表達要強于Ⅰ、Ⅱ期胃癌(22/64 vs 31/59，P=0.047)。與年齡、性別、部位沒有明顯關系(P＞0.05)。結論CD151在胃癌組織中過表達，與胃癌的Lauren分型、轉移及分期相關。

胃癌；CD151；轉移；分期

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，絕大多數胃癌患者的死亡與胃癌的侵襲、轉移、復發相關，抑制胃癌侵襲、轉移、復發是提高患者生存率的重要途徑，研究胃癌侵襲、轉移、復發的分子機制對判斷胃癌預后具有重要意義[1]。

CD151是四跨膜蛋白超家族(TM4SF)的重要成員之一，在人體細胞中廣泛表達，包括上皮細胞、心肌細胞、雪旺氏細胞、血小板等。其功能廣泛，如調節細胞生長、遷移和粘附等[2]。目前已經證實CD151與前列腺癌、結腸癌、非小細胞肺癌、肝癌等轉移、復發相關[3-6]，CD151在腫瘤組織中表達越高，患者腫瘤的轉移率越高，預后越差，有學者認為其可作為腫瘤預后的一新指標[3-7]。

目前已經證實CD151在胃癌組織中存在過表達，部分學者認為CD151過表達可能與胃癌的轉移、分化、TNM分期相關[8-9]。文獻報道中的數據部分不一致[10]，為進一步證實CD151表達與胃癌發生發展的關系，我們擴大胃癌標本量，從基因及蛋白水平上進一步驗證。

1 材料與方法

1.1 材料收集海南醫學院附屬醫院病理科2008-2013年檔存胃癌及其配對正常胃黏膜組織蠟塊123例(其中30例含胃癌轉移灶，15例含有新鮮胃癌及其配對組織)，均為胃大部或全切手術標本，有完整病史資料，具體信息見表1。所有病例均經病理確診，顯微鏡下選擇有代表性的區域進行標記、取材、制作芯片。

1.2 試劑CD151多克隆抗體購自Abcam公司，PV-9000通用型二步法免疫組化檢測試劑盒、3，3-二氨基聯苯胺(DAB)顯色液均為福州邁新生物有限公司產品。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學SP方法切片常規脫蠟、水化后30%H2O2-甲醇封閉內源性過氧化物酶5 min，(pH 6.0)高壓修復10 min，一抗4℃冰箱過夜，第2天切片恢復室溫后二抗室溫各孵育20 min，DAB顯色，蘇木精襯染。以PBS代替一抗作陰性對照。

1.3.2 組織芯片制作根據實驗研究的目的和需要，受體蠟塊設計為18×12點陣。光鏡下選擇HE標本中適宜的樣本位置，對照相應的供體蠟塊，每個標本取兩點。把各組樣本的點陣按順序排放，設陣列孔的左上方第一排第一個孔為空白標記，以免混淆方向。320個蠟塊制作成4個組織芯片。組織芯片制作具體操作步驟見應用文獻[11]。

1.4 結果判定免疫組織化學陽性產物呈棕褐色顆粒狀，位于細胞膜和(或)細胞質，采用半定量積分法判定結果：顯色度按細胞著色深淺計分(0分基本無著色；1分淺黃；2分淺棕色；3分為深棕色)。根據陽性細胞所占百分比計分，無陽性細胞為0分；陽性細胞＜20%為1分；陽性細胞20%～50%為2分；陽性細胞＞50%～75%為3分；陽性細胞＞75%以上為4分。兩種分值相乘若＞3，則為強陽性表達。芯片中每例二個點陣取平均值記為該例分值。

1.5 RT-PCR檢測組織總RNA提取參照Trizol試劑盒說明書進行操作；CD151引物由Primer 6.0引物設計軟件進行設計，選擇最佳引物，引物序列為5'-ATGGGTGAGTTCAACGAGAAG-3'(上游引物)，5'-TCAGTAGTGCTC CAGCTTGAG-3'(下游引物)；選取GAPDH基因作為內參照基因，引物序列5'-GCCAAAAGGGTCATCATCTC-3'(上游引物)，5'-GTAGAGGCAGGGATGATG TTC-3'(下游引物)。反應體系參照二步法反應試劑盒說明書，PCR產物電泳后經凝膠圖像分析儀進行積分吸光度分析并攝像。反應條件為：94℃45 s，53℃40 s，72℃45 s，30個循環，最后一次循環結束后，72℃延伸5 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下分析PCR結果。拍照后用圖像分析儀分析目的帶和GAPDH的灰度，并計算兩者的比值。

1.6 統計學方法應用SPSS18.0軟件，臨床病理參數間的比較采用四格表χ2檢驗或Fisher確切概率計算；各因素相關關系，采用Spearman等級相關分析，顯著性檢驗水準α值等于0.05。

2 結果

2.1 CD151在胃癌組織中的表達情況免疫組化染色顯示CD151在正常胃黏膜組織中局灶陽性表達，修復性上皮表達較強；82.1%(101/123)胃癌組織CD151陽性表達，表達率明顯高于配對胃黏膜組織(56/123，P＜0.01)；腸型胃癌組織100%(52/52)陽性表達，53.8% (28/52)強陽性表達，明顯高于彌漫型胃癌組織(69.0%陽性表達，39%強陽性表達，P=0.045)。CD151在胃癌組織中的具體表達情況見表1及圖1。RT-PCR顯示，在胃癌組織中CD151mRNA擴增強度明顯高于配對正常胃黏膜組織(P＜0.01)，見圖2。

表1 CD151在胃癌組織中的表達情況（例）

2.2 CD151表達與胃癌轉移的關系CD151未轉移胃癌組織強表達率為28.6%(12/42)，在轉移的癌組織中強表達率為50.6%(41/80)，兩者比較差異有統計學意義(P=0.022)。原發灶呈弱表達CD151的胃癌組織中，在轉移灶中的表達明顯增強；個別彌漫性胃癌組織，原發灶CD151表達缺失，但在轉移灶中呈弱或中等強度的陽性(見表1及圖3)。

圖1 CD151在胃癌組織中的表達

圖2 CD151在胃癌組織中表達的瓊脂糖凝膠電泳圖

圖3 CD151在轉移灶中的表達

2.3 CD151表達與胃癌分期的關系CD151的表達隨胃癌的進展表達逐漸增強，在Ⅲ、Ⅳ期胃癌組織中的表達要明顯強于Ⅰ、Ⅱ期胃癌(22/64 vs 31/59，P=0.047)。

3 討論

四跨膜蛋白超家族(TM4SF)是近年來被廣泛研究的一個跨膜蛋白家族，在人體細胞中廣泛表達。這個家族的成員參與細胞表面分子之間的連接信號傳導，在調節細胞增殖、激活以及細胞粘附活力中起重要作用。研究證明，TM4SF家族在腫瘤的生長、遷移及血管生成中起重要的作用[2，7]。迄今為止，該家族已檢測出30多個成員，其中絕大多數被認為是抑癌基因，例如CD9、CD82。它們的產物與腫瘤發展、預后呈負相關。

研究表明，CD151是TM4SF超家族中唯一的癌基因，在人類多種腫瘤細胞表面均有較高水平的表達，與腫瘤的組織分化及淋巴結轉移顯著相關[7]，與惡性腫瘤的預后、進展、治療等有密切的關系；隨著癌的進展，CD151的表達增加，患者預后變差[2-7]。并且研究證實，CD151對內皮細胞的移行及微血管形成起促進作用，在血管生成及重塑中起關鍵作用，有利于腫瘤細胞的浸潤及轉移[12]，CD151與腫瘤發展呈正相關，促進腫瘤細胞增殖、浸潤及轉移，在腫瘤惡性進展中起著重要的作用。

部分研究顯示，CD151在胃癌組織中也存在著高表達。國內的研究顯示，CD151過表達與腫瘤的分化、分期等密切相關，認為腫瘤分化越低，CD151表達越高[8-9]。最近，Sang等[10]的研究顯示，在胃癌組織中CD151的過表達與胃癌的Lauren分類及進展相關，他們的數據顯示CD151的過表達與胃癌的分化相關，但不是正相關，而是負相關。

我們的實驗結果也顯示CD151在胃癌組織中的高表達與胃癌的分期、轉移相關；我們發現CD151的表達隨分化程度的降低而表達減少，在彌漫性胃癌中表達要低于腸型胃癌。有意思的是我們實驗中發現在腸化的胃黏膜腺體呈現CD151的強陽性表達，這點可能預示CD151的過表達與腸型胃癌的發生發展有密切的關系。

出現結果的不一致性可能與研究者選用的抗體型號、技術方法、標本量等有關。為避免相類似情況的出現，我們采用組織芯片技術、自動免疫組化、大樣本、不同公司抗體進行本次實驗。

組織芯片技術與傳統的病理學技術方法相比，有高通量、高效性的優點，同時組織芯片因其體積小，采用同一標準選材、操作和判定結果，所得結果均一可靠，實驗誤差小[11]。本次實驗，組織芯片中的石蠟組織都處在相同條件、同時進行實驗，把實驗誤差控制在最小。我們實驗結果多次重復進行，采用不同公司CD151抗體進行染色，結果顯示，除個別病例陽性程度出現表達的偏差，絕大多數結果一致。

綜上所述，我們認為CD151在胃癌組織中存在過表達，在腸型胃癌及TNM分期Ⅲ、Ⅳ期胃癌組織中表達增強，與胃癌的轉移、TNM分期、lauren分型相關。

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黃幼生。E-mail：hys768811@163.com