GC-MS法測定煙熏臘肉中的甲醛含量

芮露明，彭增起*，汪 敏，張 露，姚 瑤，王復龍，張雅瑋，惠 騰，李君珂

（南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

甲醛是一種高毒性物質，具有致癌、致畸性。相關研究表明，甲醛對人體免疫系統和呼吸道均有較大影響，長期接觸低劑量甲醛會引起慢性呼吸道疾病、鼻咽癌、腦瘤、結腸癌等，還會導致新生兒染色體異常、白血病，以及引起青少年記憶力和智力的下降等嚴重后果[1-3]。此外，甲醛的基因遺傳毒性已在人工培養的哺乳動物細胞的體內實驗與動物實驗被證實[4-6]。美國環境保護署鑒于其危害性確立了甲醛的參考劑量為0.2 mg/（kg·d），當暴露量逐漸大于參考劑量時，會增加對健康造成不利影響的風險[7]。

甲醛作為一種很多生物可以產生的一種代謝產物，卻在許多食品如香菇中出現，且甲醛含40～380 mg/kg不等。而在食品保藏中人工甲醛的非法使用導致了甲醛的嚴重超標，極大地損害了人們的身體健康。在福州、大連、廣州、武漢、上海等地的一些獨立研究發現，一些采用甲醛非法處理來進行保藏的海產品，甲醛含量超過300 mg/kg，更有甚者達到4 250 mg/kg[8-10]。而熏肉制品表面也會含有大量甲醛[11-12]，這主要是木材在缺氧狀態下干餾所得，吸附聚集在產品的表面。甲醛具有一定的抗菌作用，可在一定程度上防止熏肉腐敗，與此同時也給煙熏肉制品帶來的極 大的安全隱患。

關于水產品、香菇及啤酒等食品中 的甲醛檢測方法已有報道[13-16]，而作為中國傳統特色的煙熏臘肉中甲醛測定的研究幾乎沒有，且在肉制品中也缺乏關于甲醛限量的標準，所以有必要建立一種快捷、高效、準確的方法，來測定煙熏肉制品，尤其是煙熏臘肉中甲醛含量，為標準的建立提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

熏肉、熏腸購自湖南益陽市安化縣以及重慶涪陵區當地農貿市場。

2,4-二硝基苯肼溶液（1 g/L）：稱取0.1 g 2,4-二硝基苯肼溶解于24 mL濃鹽酸中，加水定容至100 mL，過濾離心備用；緩沖溶液（pH 5）：稱取2.64 g乙酸鈉，以適量水溶解，加入1.0 mL冰乙酸，用水定容至500 mL，用pH計測定其pH值，必要時進行酸堿調節；甲醛標準溶液（純度＞99%）：100 mg/L；二氯甲烷和甲醇均為色譜級；磷酸（濃磷酸與水按體積比1∶9配制）。

1.2 儀器與設備

旋渦混合器、LFS-15流量計、320-MS氣相色譜-質譜聯用儀 德國Brüker公司；HY-04B粉碎機 北京環亞天元機械有限公司；AL104電子天平 梅特勒托利多儀器（上海）有限公司；T25分散機 德國IKA公司；臺式超速冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司；水蒸氣蒸餾裝置。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線的繪制

移取10、20、5 0 、70、100 μL甲醛溶液（100 mg/L）置于5 mL具塞比色管中，分別加入0.30 mL 2,4-二硝基苯肼溶液，置60 ℃水浴30 min，然后在流水中快速冷卻，加入2 mL二氯甲烷，用旋渦混合器振蕩萃取1 min，4 000 r/min離心5 min使溶液分層，取上清液再用1 mL二氯甲烷萃取1 次，合并2 次萃取的下層黃色溶液，將萃取液經無水硫酸鈉柱脫水，60 ℃水浴蒸干，冷卻。取1.0 mL甲醇溶解殘渣，經0.22 μm濾膜過濾后上機分析。制作甲醛標準曲線，確定標準曲線范圍。

1.3.2 熏肉樣品的前處理

采用水蒸氣蒸餾法進行前處理，具體參照朱易等[17]的方法并稍作修改。

1.3.3 樣品衍生化與萃取

取蒸餾液1.0 mL，置于5 mL具塞比色管中，分別加入0.30 mL 2,4-二硝基苯肼溶液，置60 ℃水浴30 min，然后在流水中快速冷卻，加入2 mL二氯甲烷，用旋渦混合器振蕩萃取1 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液再用1 mL二氯甲烷萃取1 次，合并2 次萃取的下層黃色溶液，將萃取液經無水硫酸鈉柱脫水，60 ℃水浴蒸干，冷卻。取1.0 mL色譜純甲醇溶解殘渣，經0.22 μm濾膜過濾后作分析用。

1.3.4 氣相色譜-質譜分析條件

1.3.4.1 氣相色譜條件

色譜柱：DB-5彈性石英毛細管柱；柱溫60 ℃；進樣口溫度260 ℃；程序升溫：以10 ℃/min升溫速度升至150 ℃，然后升溫至260 ℃，恒溫5 min；載氣He；柱前壓40 kPa；分流比10∶1；溶劑延遲5 min；進樣量1 μL。

1.3.4.2 質譜條件

電子電離源；電子能量70 eV；四極桿溫度150 ℃；離子源溫度230 ℃；電子倍增器電壓1.02 kV；接口溫度250 ℃；選擇離子檢測m/z 79、210。

1.3.5 加標回收率

取3 種不同肉樣（本底不含甲醛）粉碎，準確稱取2.0 g，分別加入10、20、30 mg/kg不同含量的甲醛，按實驗方法衍生、萃取、上機檢測，根據標準曲線計算樣品以及不同加標水平下的甲醛提取量。

1.3.6 重復性實驗

在臘肉樣品中（本底不含有甲醛）加入相當于樣品5 mg/kg的甲醛標準溶液，樣本量為6，按實驗方法前處理、衍生、萃取、上機測定，考察方法的精密度。

1.3.7 檢出限

方法的檢出限定義為產生3倍信噪比（RSN=3）的化合物的質量濃度，選取空白肉樣（本底不含甲醛），樣本量n=6，分別加入10 μL的甲醛標準溶液，然后進行衍生、萃取、上機檢測，得出檢出限。

1.4 統計分析

數據以平均值±標準偏差表示，用M icrosoft Excel統計處理，用SPSS 18.0統計軟件進行線性分析和鄧肯多重比較，P＜0.05表示 差異有顯著性。

2 結果與分析

2.1 衍生反應

醛類物質可在酸性介質中與2,4-二硝基苯肼反應形成較穩定的希夫堿， 本實驗中生成的2,4-二硝基苯腙，反應式如下：

衍生劑用量和酸性是影響衍生反應的重要因素。適量的酸有助于促進甲醛與2,4-二硝基苯肼的反應[18-19]，然而過多的酸將會損壞毛細管柱。稱取0.1 g 2,4-二硝基苯肼溶解于24 mL濃鹽酸中，加水定容至100 mL。

2.2 氣相色譜-質譜條件的確定

2.2.1 色譜柱的選擇

選用DB-5彈性石英毛細管柱，因其較好的惰性與柔性，吸附和催化性較小，適于目標化合物的分析。

2.2.2 柱溫的選擇

預實驗中發現當選擇210 ℃恒溫時，衍生物的出峰時間較早，峰形矮胖且分岔，檢測靈敏度不高。當采用程序升溫，以10 ℃/min升溫速度升至150 ℃，然后升溫至260 ℃，恒溫5 min。出峰時間在18 min左 右，峰形與重復性較好，靈敏度也較高。

2.2.3 測定方法與特征離子的選擇

由于煙熏臘肉基體復雜，用高效液相色譜或氣相色譜法測定基質干擾較大，結果往往偏高。通常需層析柱再進行洗脫凈化，操作繁瑣。回收率比較低。故選用氣相色譜-質譜選擇離子檢測，這樣可消除雜質對檢測的干擾，選擇性明顯提高。靈敏度比全掃描模式提高兩個數量級。衍生產物2,4-二硝基苯腙的質譜圖見圖1。2,4-二硝基苯腙的碎片離子豐度中最大的峰為m/z 63，其次為m/z 79，且兩者差距不大，分子離子峰為m/z 210。根據選擇離子的原則，應盡量選擇質荷比較大的特征離子，以提高準確度；同時選擇豐度較大的離子，以提高檢測的靈敏度。如圖2所示，選擇離子掃描可很好地排除雜質峰的干擾。綜上考慮，選擇m/z 79和m/z 210為參考檢測離子，以消除雜質峰的干擾影響，保證檢測的準確性與靈敏度。

圖 1 2,4-二硝基苯腙的質譜圖Fig.1 Mass spectrum of 2,4-dinitrobenzene formaldehyde hydrazone

圖 2 總離子流和特征離子色譜圖Fig.2 Total ion current and selected ion chromatograms

2.3 衍生化與萃取處理條件優化（甲醛標液添加量均為50 μL）

2.3.1 衍生劑用量

圖 3 峰面積隨衍生試劑用量變化的曲線Fig.3 Peak area vs. derivatization agent dosage

理論上，任何能與羰基反應的大分子有機物質都可以作為本實驗的衍生化試劑。綜合篩選，本實驗選用2,4-二硝基苯肼做為衍生劑，其主要特點是相對分子質量適中，在常溫條件下反應完全、快速。由圖3可知，衍生產物的峰面積隨著衍生化試劑用量的增加，在0.3 mL之前呈上升的趨勢，0.3 mL之后呈下降的趨勢，幅度較小。在用量0.3 mL處，峰面積最大，所以50 μL甲醛添加量的最佳衍生劑用量為0.3 mL。

2.3.2 衍生化時間

由圖4可見，隨著衍生化時間的延長，2,4-二硝基苯腙產物的峰面積增大，但并非呈一直增加的趨勢。當衍生化時間在30 min以內時，峰面積的響應值隨時間的延長而增加，而隨后又下降，在30 min處達最高值。所以，衍生化時間選擇30 min。

圖 4 峰面積隨衍生化時間變化的曲線Fig.4 Peak area vs. derivatization time

2.3.3 衍生化溫度

圖 5 峰面積隨衍生化溫度變化的曲線Fig.5 Peak area vs. derivatization temperature

由圖5可見，隨著衍生化溫度的升高，2,4-二硝基苯腙產物的峰面積增大，但并非是一直增大，當衍生化溫度在60 ℃以內時，峰面積的響應值隨溫度的升高而增加，而隨后又下降，在60 ℃條件下達最高值。所以，衍生化溫度選擇60 ℃。對于更準確具體的最適衍生溫度，可以進行進一步的探索。

2.3.4 萃取次數

二氯甲烷的用量和萃取的次數直接影響衍生物萃取率，從而間接影響測定的結果。實驗中第1次萃取用2 mL，隨后的每次用量為1 mL。如圖6顯示，2 次萃取后，萃取基本完全。盡管二氯甲烷是色譜級，但過多的萃取劑二氯甲烷仍會多帶入一些雜質，從而影響結果的準確性。所以，從檢測準確性與成本考慮選擇二氯甲烷萃取，第1次萃取用2 mL，隨后的每次用量為1 mL，萃取2 次。

圖 6 峰面積隨萃取次數變化的曲線Fig.6 Peak area vs. extraction number

2.4 甲醛質量濃度標準曲線

按照1.3.1節方法，以甲醛質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為y=22 974.8x－0.194 63，R2=0.999 7，在甲醛反應液質量濃度為0.1～15 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.5 驗證實驗

2.5.1 加標回收率

在臘肉樣品中（本底不含有甲醛）分別加入相當于樣品質量分數分別為0.5、1.5、5 mg/kg的甲醛標樣進行測定，計算出回收率結果見表1。

表 1 臘肉制品中甲醛加標回收率Table 1 Recoveries and precision (RSD) for formaldehyde standard added to smoked meat

2.5.2 重復性實驗

按照1.3.6節方法處理，重復6 次實驗，得到相對標準偏差為2.89%。表明本法具體很好的重復性。

2.5.3 檢出限

按上述分析方法，在不含甲醛的樣品本底中添加一定量的甲醛標準進行實驗，最低檢測質量濃度0.01 mg/L，以取樣量2.0 g計，本法對樣品的檢出限為0.50 mg/kg。

2.6 甲醛含量的測定

從重慶與湖南購買4 個品牌的臘肉，每個品牌購買3 袋，按照1.3.2、1.3.3節的方法進行前處理衍生化，按照1.3.4節的色譜條件進行測定，每個樣品取表層（表面0.5 cm厚）與內部各3 份，每份平行測定3 次，取平均值，所測樣品中甲醛的含量結果見表2。利用所建立的方法對市售臘肉中甲醛含量進行了分析，4 種臘肉表層與內部均存在著一定量的甲醛。從表2可以看出，所檢測的熏肉制品中甲醛含量均較高，最高甚至達到了254.52 mg/kg。煙熏臘肉表層甲醛含量要大于內部。

表 2 不同樣品臘肉甲醛的含量Table 2 Formaldehyde contents of different smoked meats mg/kg

3 討 論

現在關于食品中甲醛的測定的研究主要集中在啤酒、蘑菇、海產品等樣品，李軍[20]、王宏華[21]等對啤酒中甲醛含量的測定進行研究，鄭斌[22]、迂君[23]等對水產品、海產品中甲醛測定開展相應研究，還有研究者用衍生-液相色譜法檢測香菇中的甲醛含量。而熏肉制品中的甲醛檢測方法卻鮮有報道。熏肉制品由于質地較干硬、存在著脂肪與蛋白質等雜質的干擾，使得甲醛的提取存在著一定的困難。

在酸性環境中，甲醛極易揮發出來，影響測定結果，水蒸氣蒸餾可以很好解決這一問題。本實驗在傳統的水蒸氣蒸餾裝置的基礎上進行了改進，將原來的圓底燒瓶換成了半微量的定氮整流器，有效地降低了樣品量，從而提高回收率。實驗對衍生化以及萃取處理的條件進行了優化，具體有衍生劑用量、衍生化時間、衍生化溫度、萃取次數4 個因素，這些因素直接影響的檢測的結果。

衍生劑用量過少，衍生化不充分，過多，因為衍生劑本身的純度則會給樣品帶來新的雜質，而衍化時間過長衍生溫度過高，則會影響衍生產物的穩定性。混合液萃取2 次以后，峰面積增加不顯著。結合實驗結果，選擇加入0.3 mL 2,4-二硝基苯肼、衍生化溫度60 ℃、衍生化時間30 min、用二氯甲烷進行萃取、萃取2 次。

目前在甲醛檢測方法的研究中，各研究者所研究的研究對象各不相同，再加上儀器設備條件參差不齊，因此每個方法各有側重點，也各有優劣。與其他甲醛檢測的方法相比，本方法色譜條件更為簡單，前處理對樣品本身的物理特性依賴性小。從方法學評價結果來看，樣品的干擾基質少，具有較低的檢測限以及較好的回收率和精密度，能夠滿足檢測的要求。

實際樣品中甲醛含量的測定結果表明有些煙熏臘肉的甲醛含量令人堪憂，如何在保留傳統煙熏肉制品獨特風味的基礎上降低或消除甲醛的安全風險，已成為對傳統煙熏肉制品發展的一個挑戰。

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