傅里葉變換近紅外光譜技術測定綠茶全氮量

楊 丹，劉 新*，張穎彬，尹 鵬

（中國農業科學 院茶葉研究所，農業部茶葉質量監督檢驗測試中心，浙江 杭州 310008）

全氮量與綠茶品質密切相關，是重要的品質指標值[1]，綠茶中的總氮主 要包括蛋白質、游離氨基酸、生物堿、葉綠素、芳香物質中的含氮化合物等成分中的氮。綠茶中全氮量的傳統測定方法以凱氏定氮法[2]為主，此測定方法存在測定時間長、過程繁瑣、污染環境等缺陷。近紅外光譜技術是一種綠色、快速、高效的新型定性、定量分析技術，目前在農產品[3-4]、食品工業[5-6]等領域已廣泛應用，是近年來發展最快的測定技術之一，在茶葉及茶制品的理化檢測、品質評價、真偽識別等方面也表現 出巨大的潛力。

日本最早開始研究近紅外光譜技術在茶葉中的應用，測定綠茶中包括總氮量在內的主要化學成分[7-8]，已研制出專門的近紅外分析 儀，廣泛應用于茶葉的品質檢測以及茶葉生產加工過程中的質量管理[9-10]。而我國有關近紅外光譜技術還處于實驗室研究階段，主要集中在成品茶[11-12]、茶湯[13-15]、茶鮮葉[3,16]常規理化成分的測定和茶葉種類產地識別[17-19]等方面，關于應用現代近紅外光譜（near infrared spectroscopy，NIR）技術檢測綠茶中全氮量的研究報道甚少，與日本相比，我國茶葉因茶樹品種、種植地域、加工工藝的不同，綠茶種類繁多，有必要研制出適用于我國茶葉品質檢測的實用模型。

本實驗將開展利用傅里葉變換近紅外光譜（fourier transform near infrared spectroscopy，FT-NIR）技術檢測綠茶全氮量的研究，以期建立穩定性好、精確度高的綠茶全氮量近紅外分析模型。全氮量與綠茶嫩度密切相關，鮮葉原料品質的優劣，主要與鮮葉嫩度相關。綠茶的嫩度等級從單芽、一芽一葉、一芽二葉直到較粗老產品，全氮量的變化趨勢明顯且較易分類，為了進一步提高綠茶全氮量近紅外定量分析模型的預測準確度，對綠茶樣品進行評審分類，建立綠茶全氮量不同嫩度等級的子模型。希望通過本實驗的研究，能推進近紅外光譜技術在茶葉成分檢測中的應用推廣，提高茶葉產品相應的品質檢測水平。

1 材料與方法

1.1 材料及制備

選用2011—2012年的具有代表性的綠茶樣品425 個，每年分多次取樣且所有樣品各不相同，不斷的增加模型中的樣本數量。為了更好的增加穩定性，每個樣品均在同一天測定化學值并采集光譜圖。樣品覆蓋全國主要 產茶區，包含茶樹品種不同（中小葉種、大葉種）、老嫩度差異明顯，加工工藝不同（炒青、烘青、蒸青等）的樣品。每份樣品取30 g左右，選用0.5 mm的篩網，粉碎離心過篩，得到粒度均勻的粉碎樣。

1.2 儀器與設備

AntarisⅡ傅里葉近紅外光譜分析儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；KJELTEC2300全自動定氮儀 瑞典Foss Tecator公司；ZM200超離心研磨機（0.5 mm的篩網） 德國Retsch公司。

1.3 方法

1.3.1 全氮量的測定

采用凱氏定氮法，稱取0.5 g綠茶粉碎樣于消化管，加入濃硫酸與催化劑消解，用全自動定氮儀測定每份樣品全氮量，同時測定茶樣的干物質率，將全氮量以干態質量分數表示。取3 次平行測定的平均值 為每個樣品的實際測定值。

1.3.2 光譜采集

采用傅里葉近紅外光譜分析儀掃描粉碎過篩的樣品，每個樣品重復裝樣3 次，裝樣量（20、10 mL小燒杯）、樣品松緊度（金屬圖章壓實）， 掃描次數64 次，分辨率4 cm－1，光譜采集范圍3 800～12 000 cm－1，旋轉裝樣皿，每個樣品掃描前均采集背景光譜。

1.3.3 綠茶全氮量校正模型的建立與外部驗證

考慮到樣品量較大，根據全氮量含量大小排序，平均隔n 個樣品選擇1 個樣品的方式來選擇驗證集的方法較為繁瑣，且前期實驗的預測結果比較也與TQ軟件自動選擇的相當。本實驗利用TQ軟件自動選擇325 個樣品作校正集，全譜波段下采用偏最小二乘（partial least square，PLS）回歸法建立校正模型。對光譜進行預處理：多元散射校正（multiplicative signal correction，MSC）、標準正態變量變換（standard normal variate，SNV）、一階導數（first derivative，FD）、卷積平滑法（savitzky-golay filter，SG）、Norris導數濾波（norris derivative，ND）。比較對校正模型的影響；選擇波段區間：考慮全譜區、避開儀器噪聲信號、水分、水蒸氣吸收波數區間、選擇氮的特征吸收波段區間；對校正模型進行內部交叉驗證。

選擇余下100 個樣品作外部驗證集，驗證模型的預測性能。所有數據處理均在儀器自帶的TQ Analyst軟件中進行，以校正集樣品的均方差（RMSEC）、交叉驗證均方差（RMSECV）、相關系數、因子數為指標來優化模型，以驗證集樣品的預測均方差（RMSEP）、相關系數和性能指數考察模型的預測準確度。

1.3.4 綠茶樣品的嫩度分級與子模型的建立

根據GB/T 23776—2009《茶葉感官審評方法》，對425 個綠茶樣品進行感官審評，并根據老嫩度的明顯差異進行分級：從單芽、一芽一葉、一芽二葉以及較粗老的精制茶等，共6 個等級。

將綠茶樣品根據嫩度等級在全譜波段下采用PLS建立綠茶全氮量的子模型，不進行光譜預處理。按全氮量排序，隔n選1的方式，每個嫩度等級分別選出6 個驗證集樣品，余下的為校正集樣品。將各嫩度等級的校正集樣品合并，建立全氮量總校正模型。各子模型和總模型預測驗證集樣品全 氮量，評價子模型預測性能。

2 結果與分析

2.1 綠茶全氮量的實測值

隨著綠茶嫩度的增加，全氮含量越高，結果見表1。特級到2級都屬于較嫩的茶，從單芽到一芽二葉，多為名優綠茶。嫩度等級被評為3級的樣品以大宗型綠茶居多，炒青較多。嫩度等級被評為4級和5級的樣品的全氮量均值為4.48%、3.89%，屬于比較粗老的綠茶，如珠茶、眉茶等。

表 1 綠茶全氮量實測值Table 1 Measured values of total nitrogen content in green tea

2.2 綠茶近紅外平均光譜圖

從圖1可知，波段區間3 900～5 100 cm－1范圍內近紅外透光率大，信息量豐富。12 000～10 200、3 900～3 800 cm－1處儀器產生的噪聲信號較大；在5 100～5 600 cm－1，6 900～7 400 cm－1之間仍會受水蒸氣的影響產生了較小的噪聲信號。因 此在模型建立時需要考慮是否有必要避開這些波數區間。氮的NIR吸收主要與N—H的分子振動相關。有學者研究表明：N—H鍵伸縮振動的一級倍頻在6 666 cm－1附近，伸縮振動與彎曲振動的組合頻在5 000 cm－1附近，帶有N—H的雜環芳香化合物，較強的一級倍頻出現在6 835 cm－1，組合頻出現在4 715 cm－1附近[20]。而蛋白質的特征譜帶為10 277～9 804 cm－1、6 667～6 536 cm－1的N—H倍頻吸收，以及4 878～4 854 cm－1的N—H組合頻吸收，4 613～4 587 cm－1的N—H與C=O/N—H /C—N組合頻[21]。因此在模型建立時需要考慮特征波數區間的選取。

圖 1 綠茶近紅外平均光譜圖Fig.1 Average near-infrared spectrogram s of green tea

2.3 波段選擇與光譜預處理對綠茶全氮量模型的影響

采用PLS回歸法建立模型，采用TQ軟件中的Spectrum Outlier diagnostic排除偏差較大的9 個異常值，最終確定選擇316 個樣品作校正集，在全譜波段3 814～12 000 cm－1范圍內建立的綠茶全氮量的PLS校正模型。各波段區間的模型在最佳光譜預處理下的預測結果如表2所示。

表 2 波段區間與光譜預處理選取對全氮量模型預測性能的影響Table 2 Model statistical parameters for total nitrogen content under different wavebands and spectral pretreatments

以R M S E P為評價指標，從表2可以看出，在4 691～3 959、5 126～4 848 cm－1（序號6）兩波段區間內的模型預測性能最好，此區間內包含了主要的N—H鍵、N—H與C—N鍵、N—H與C=O鍵的特征吸收波數，且避開了模型的水分與噪聲干擾，光譜經過一階導數與SG平滑處理后，驗證集樣品的預測值與實測值的RMSEP為0.092 5%。此外，與在全譜區（序號1）建立的模型相比，當波段區間避開水分、水蒸氣吸收、儀器噪聲后，模型的預測結果略好，RMSEP由原來的0.098 0%降到0.093 8%（序號2）和0.093 1%（序號8），因子載荷圖也降低了一維。實驗結果證明，在建模之前根據組分吸收近紅外的信息對波數區間進行選擇，是一種有效的優化模型方法，有助于減少噪音信號的影響、提高運算速率和模型的穩定性。

2.4 綠茶全氮量校正模型的建立與外部驗證

圖 2 綠茶全氮量的校正模型與外部驗證結果Fig.2 Calibration model of total nitrogen content in green tea and external verification results

采用優選后的波段區間和一階導數與SG平滑處理，建立了綠茶全氮量的偏最小二乘模型，校正模型的因子載荷圖見圖2b，在建模因子為9時，RESECV值趨于平緩，已降到最低值，因此選擇9個因子建立校正模型。模型因子數為9時，316 個校正集的綠茶樣品全氮量的實測值與預測值見圖2a；所有校正集樣品的綠茶全氮量的實測值與預測值的校正均方差（RMSEC）為0.088 4%，預測誤差在0.001 1%～0.325 9%之間（圖2d），平均預測誤差0.069 2%，相關系數為0.994 8。為了更好的評價模型的預測性能，選擇100個樣品作外部驗證集；用已建立的校正模型對其進行預測，預測結果如圖2c所示：驗證集樣品的全氮量的預測值與實測值的RMSEP為0.092 5%，預測誤差在0.191 2%～0.0001%之間（圖2d），平均預測誤差0.079 3%，相關系數為0.993 9，綠茶全氮量模型的預測結果很好。

將100 個驗證集樣品全氮量的實測值與模型預測值采用SAS軟件進行T檢驗分析，標準偏差為0.009 9，在0.05顯著性水平下，T值為－0.18，P值為0.859 8，2 種測定方法無顯著性差別，可以應用傅里葉近紅外光譜技術快速測定綠茶全氮量。

2.5 綠茶全氮量子模型的建立與外部驗證

表 3 全氮量子模型統計參數Table 3 Statistic parameters of sub-models for total nitrogen content

從表3可以看出，綠茶樣品根據嫩度等級分類后，建立的各子模型的校正集樣品的RMSEC均有不同程度的降低。與嫩度總模型的預測性能相比，特級、1、3、5級的RMSEP值均值低于總模型。其中3、5級子模型的相關系數均在0.99以上。在校正模型的建立與應用中，根據嫩度等級來建立子模型，可以提高模型的預測性能。3級子模型的對3級驗證集樣品的預測結果最好，樣品的全氮量的預測值與實測值的RMSEP值最小，為0.037 9，相關系數為0.996 1。

各子模型對驗證樣品的預測值與實測值的比較，見表4。嫩度等級評為特級、1、5級的驗證集樣品的子模型預測結果（平均偏差分別為0.007%、0.018%、0.026%）均優于總模型的預測結果（平均偏差分別為0.057%、0.041%、0.097%），其中特級樣品采用特級子模型預測全氮量時，驗證樣品的預測值與實測值的平均偏差最小，為0.007%，預測值最接近實測值，而采用中小葉種和總模型預測時，其平均偏差相對較大，分別為0.049%、0.057%。3級驗證集樣品用總模型和3級子模型預測時，其平均偏差都很小，分別為0.015%、0.018%，預測值接近實測值；因此，對于嫩度較好的樣品，采用嫩度相應的子模型對其進行預測，可以提高其預測性能。對于粗老的5級樣品，采用5級子模型進行預測，預測結果更好。對于嫩度一般的3級樣品，由于總模型中3級樣品總量最多，是其他樣品的2～3 倍，因此進行預測時，采用子模型與總模型的預測結果相當。這也說明了校正集代表性樣品數量的重要性。

表 4 驗證集樣品的實測值與預測值Table 4 Actual measured and calculated values of the validation set%

3 結 論

傳統的凱氏定氮法，不僅費時，還需大量試劑，本實驗采用偏最小二乘法，結合傅里葉變換近紅外光譜儀，建立了近紅外光譜技術測定綠茶含氮的定量分析模型，模型能滿足綠茶全氮量的快速檢測要求。驗證集樣品的RMSEP為0.092 5，相關系數分別為0.993 9。此外，綠茶種類繁多，嫩度不一，實驗根據嫩度等級，建立了綠茶全氮量子模型，提高了模型的預測性能。與總模型的預測性能相比，特級、1級、3級、5級的RMSEP值均低于總模型。嫩度為3級的子模型預測結果最好，樣品的全氮量的預測值與實測值的RMSEP值最小，為0.037 9，相關系數為0.996 1。每年可繼續添加新樣品來優化模型，提高模型的實際檢測性能，進一步推廣近紅外 光譜技術在茶葉品質快速檢測領域的應用。

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