實時熒光聚合酶鏈式反應檢測轉基因小麥B73-6-1、B72-8-11b和B102-1-2品系

曹際娟，徐君怡，曹冬梅，張丕橋,2，欒鳳俠，劉 洋

（1.遼寧出入境檢驗檢疫局，遼寧 大連 116001；2.遼寧師范大學生命科學學院，遼寧 大連 116029；3.黑龍江出入境檢驗檢疫局，黑龍江 哈爾濱 150001）

隨著轉基因作物的不斷商業化，轉基因食品的安全性問題已逐漸成為公眾關注的焦點。世界各國都在努力制定相應的法律和法規，以加強對進出口轉基因植物及其產品的管理。轉基因生物檢測技術是安全評價的關鍵之一[1]。轉基因檢測已成為市場準入的重要檢測指標。目前，應用最為廣泛的是基于核酸水平的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）和實時PCR檢測技術，可以實現對轉基因產品通用元件的篩查檢測[2]，對目的基因的特異性檢測[3]，對轉化載體構建的特異性檢測[4]，以及對轉基因產品轉化事件側翼序列的特異性檢測（即品系鑒定）[5]。隨著進出口貿易的發展，僅僅確定是否含有轉基因成分已無法滿足需要，還要確定轉基因產品是否被輸入國所批準，即進行轉化事件的品系鑒定，特別是在進出口貿易中新出現的轉基因產品低水平混雜（low level presence，LLP）問題[6]，更需要精準的檢測方法作技術保障，這成為國際上轉基因產品檢測技術的發展趨勢[7]。小麥作為世界主要糧食來源，其種植面積、總產量和總貿易額均居各類作物之首，其轉基因遺傳改良受到廣泛關注[8]。從1992年第一株轉基因小麥在美國問世至今20多年來，國內外應用轉基因技術對小麥進行了大量研究，并在抗蟲、抗旱、抗病毒、雄性不育、品質改良等方面取得了很多成績[9-13]。轉基因小麥B73-6-1和B72-8-11b是由基因槍將p1Dx5、pAHC25兩個質粒通過共轉化轉入普通小麥品種中得到的[10]。B73-6-1的p1Dx5質粒攜帶高分子質量麥谷蛋白亞基HMW-GS基因、B72-8-11b的p1Dx5質粒攜帶高分子質量麥谷蛋白亞基1Dx5基因均可提高面筋含量、改良小麥品質，由自身胚乳特異啟動子驅動；pAHC25質粒攜帶標記基因uidA和抗除草劑基因bar，上游連接廣譜ubiquitin啟動子。轉基因小麥B102-1-2品系則是利用基因槍法將pAHc25和pHMW lAxl轉化到小麥L88-31上而獲得lAxl基因超表達的轉基因品系，改善了面粉烘烤品質[10]。

本研究的目的是建立轉基因小麥B73-6-1、B72-8-11b和B102-1-2品系特異性鑒定的實時PCR方法，以辨別具有相同外源基因的不同轉基因作物品系，并為進出口貿易中轉基因產品LLP問題的出現和解決方案做好技術儲備。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

轉基因小麥B73-6-1、B72-8-11b、B102-1-2粉末樣品由黑龍江出入境檢驗檢疫局提供；對照樣品轉基因玉米Bt176、轉基因玉米MON88017、轉基因玉米MIR604、轉基因大豆89788、轉基因稻米LLRice62購于美國油類化學家學會（AOCS）；非轉基因小麥京冬小麥6號、鄂麥18、川麥107非轉基因小麥分別購于四川省種子公司、湖北省種子公司、江西省種子公司；GMO DNA提取試劑盒（TaKaRa Code No.D9093）、實時PCR Buffer、Taq DNA聚合酶、dNTP 寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設備

7500型實時PCR擴增儀 美國ABI公司；Mupid型核酸電泳儀 日本Advance-Bio公司；ND-1000型超微量紫外-可見分光光度計 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA提取

樣品粉末分別在液氮中研成細末，提取基因組DNA。提取的DNA溶于100 L TE緩沖液中，采用超微量分光光度計對基因組DNA進行純度、濃度測定，且OD260nm/OD280nm在1.7～2.0較合適。

1.3.2 引物和探針的設計

在文獻[14-16]基礎上，采用Beacon Designer 7.91軟件，分別在跨邊界序列的前端或后端設計該3種小麥品系鑒定的引物和探針（表1）。引物和探針由寶生物工程（大連）有限公司合成。探針的5’端標記羧基熒光素（FAM），3’端標記非熒光染料淬滅報告基團（Eclipse）。

表 1 小麥內源基因及3種轉基因小麥品系鑒定的引物和探針序列Table 1 Primers and probes targeting wheat endogenous genes and event specific detection of transgenic wheat strains

1.3.3 實時PCR反應體系及反應程序

25 L的反應體系：在0.2 mL的PCR反應管中，加入正向引物（10 μmol/L）0.8 μL、反向引物（10 μmol/L）0.8 μL、探針（10 μmol/L）1 μL、2×PCR預混合緩沖液（含Mg2+和dNTPs 0.4 mmol/L，Ex Taq HS 1.25 U/25 μL）12.5 μL、模板DNA（0.1～2 μg）2 μL，水補足至25 μL。實時PCR反應程序為：預變性95 ℃，3 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；40 個循環。

1.3.4 靈敏度檢測

以實時熒光PCR鑒定B73-6-1品系為例進行靈敏性實驗。研磨B73-6-1品系樣品并過80 目篩處理后，以不同質量分別添加到非轉基因小麥粉基質中，制備成轉基因含量為10%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、0.007%、0.005%、0.003%、0.001%（m/m）的共10 個梯度添加樣品，分別進行檢測。

2 結果與分析

2.1 模板gDNA的定量檢測和小麥內源基因的擴增

各取轉基因小麥B73-6-1、B72-8-11b、B102-1-2和京冬小麥6號等基因組DNA 1 L，進行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測基因組DNA純度。此外，各取1 μL基因組DNA，使用超微量分光光度計進行純度、濃度鑒定。由圖1、表2可見，基因組DNA純度和濃度均符合實時PCR檢測要求。

圖 1 部分模板gDNA的1%瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 One percent agarose gel of electrophoresis the template gDNA

表 2 3 種轉基因小麥基因組DNA純度和濃度Table 2 Purities and concentrations of the genomic DNAs isolated from three transgenic wheat strains

為進一步驗證小麥模板gDNA的提取效果，采用Wx012F/Wx012R引物和Wx012P探針，經實時PCR擴增小麥種內源的Wx012基因。每個樣品進行2次重復，結果如圖2所示。轉基因小麥B73-6-1、B72-8-11b、B102-1-2以及對照的非轉基因小麥（京冬小麥6號、鄂麥18、川麥107）均檢測出熒光增幅曲線，而對照樣品非小麥樣品（轉基因玉米Bt176、轉基因玉米MON88017、轉基因玉米MIR604、轉基因大豆89788、轉基因稻米LLRice62等）均未出現熒光增幅現象，表明Wx012F/Wx012R引物和Wx012P探針具有檢測小麥內源基因的特異性，可用于轉基因小麥檢測中的內源質控。

圖 2 小麥內源基因的實時熒光PCR擴增圖譜Fig.2 Real-time PCR amplification plot of wheat endogenous genes

2.2 品系特異性檢測結果

2.2.1 實時PCR特異性鑒定B73-6-1品系

使用B73F/B73R引物和B73P探針進行實時PCR擴增轉基因小麥B73-6-1、B72-8-11b、B102-1-2品系及對照樣品和非轉基因小麥的基因組DNA，每個樣品進行6次重復。由圖3A可見，B73F/B73R引物和B73P探針僅檢測出轉基因小麥B73-6-1品系的熒光增幅曲線，而其他樣品均未出現熒光增幅現象，表明B73F/B73R引物和B73P探針具有檢測轉基因小麥B73-6-1品系的特異性。

圖 3 轉基因小麥B73-6-1（A）、B72-8-11b（B）、B102-1-2（C）品系特異性的實時熒光PCR擴增圖譜Fig.3 Amplification plots of event-specific real-time PCR for transgenic wheat strain B73-6-1 (A)、B72-8-11b (B)、B102-1-2 (C)

2.2.2 實時PCR特異性鑒定B72-8-11b品系

使用B72F/B72R引物和B72P探針進行實時PCR擴增檢測轉基因小麥B73-6-1、B72-8-11b、B102-1-2品系及對照樣品和非轉基因小麥的基因組DNA。每個樣品進行6 次重復。由圖3B結果可見，B72F/B72R引物和B72P探針僅檢測出轉基因小麥B72-8-11b品系的熒光增幅曲線，而其他樣品均未出現熒光增幅現象，表明B72F/B72R引物和B72P探針具有檢測轉基因小麥B72-8-11b品系的特異性。

2.2.3 實時PCR特異性鑒定B102-1-2品系

使用B102F/B102R引物和B102P探針進行實時PCR擴增轉基因小麥B73-6-1、B72-8-11b、B102-1-2品系及對照樣品和非轉基因小麥的基因組DNA。每個樣品進行6 次重復性實驗。實時PCR擴增曲線見圖3C。由圖3C可見，B102F/B102R引物和B102P探針僅檢測出轉基因小麥B102-1-2品系的熒光增幅曲線，而其他樣品均未出現熒光增幅現象，表明B102F/B102R引物和B102P探針具有檢測轉基因小麥B102-1-2品系的特異性。

2.3 實時PCR檢測靈敏度結果

以B73-6-1品系為例，測定本方法的檢測限，結果如圖4所示。本方法對B73-6-1品系樣品的檢測限可以達到0.01%（m/m），而0.007%含量以下的樣品則熒光信號在基線以下，屬于陰性結果。DNA提取和實時熒光PCR的過程均重復了6 次，結果都一致。

圖 4 B73-6-1品系的實時熒光PCR靈敏度檢測圖譜Fig.4 Real-time PCR amplification plots for its sensitivity for detection of transgenic wheat strain B73-6-1

3 討 論

由于小麥是異源六倍體作物，基因組中含有A、B、D 3組染色體，其中3組染色體中An、Bn、Dn同源基因之間具有很強的互補性，使得小麥的遺傳機理更復雜[18-20]，所以轉基因小麥的研究比其他轉基因作物更加困難。品系鑒定的轉化事件特異檢測是通過擴增側翼序列（受體基因組和插入DNA的連接區域）來鑒定含有相同外源DNA的不同轉基因生物[5]。轉基因小麥B73-6-1、B72-8-11b和B102-1-2是由Barro等[10]于1997年構建成功，其結構復雜，已有篩選檢測方法的文獻[21]報道，也有通過染色體步移測序技術獲取了此3種轉基因小麥的側翼序列，并建立了PCR鑒定方法的報道[14-16]。然而PCR方法中擴增產物需要電泳檢測，操作繁瑣，易引發污染和假性結果。而實時熒光PCR具有快捷、準確的優勢，已有廣泛應用該技術鑒定轉基因產品的文獻報道[23-25]。為此，本研究在前期研究的基礎上，分別在跨邊界序列的前端或后端重新設計該3種小麥品系鑒定的引物和探針，經過特異性實驗和靈敏度實驗，建立了簡便、快捷、準確的轉基因小麥品系特異性鑒定的實時熒光PCR方法，為特異性鑒定轉基因小麥B73-6-1、B72-8-11b和B102-1-2品系提供了更為有效的方法。這將為準確、快速、高效地檢測轉基因作物及其產品的標準制定和試劑盒的開發提供技術支持，具有較大的應用價值。

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