應用DPO-PCR技術檢測腸出血性大腸桿菌O157∶H7

徐義剛，李丹丹，崔麗春，劉忠梅，李蘇龍

（1.黑龍江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，黑龍江 哈爾濱 150001；2.海南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，海南 海口 570125；3.東北林業(yè)大學研究生院，黑龍江 哈爾濱 150040）

腸出血性大腸桿菌（enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC）是大腸桿菌的一個亞型，主要致病菌株血清型為O157∶H7，呈全球性分布，可產生志賀氏毒素樣細胞毒素[1-2]。畜禽為本病儲存宿主和主要傳染源，如牛、羊、豬等，以牛帶菌率最高。EHEC O157∶H7傳播途徑復雜多樣，主要通過進食被污染的食物、水或與病人接觸而傳染，出現(xiàn)腹瀉、出血性結腸炎、溶血性貧血和溶血性尿毒綜合征等臨床癥狀[3-6]。常見被污染的食物有牛肉、牛奶及其制品、禽肉、羊肉、蔬菜和水果等，快餐類食品極易造成暴發(fā)性食物中毒。EHEC O157∶H7引起的危害受到廣泛關注，建立快速、準確的檢測方法對防控該致病菌具有重要意義。

傳統(tǒng)的檢測方法（分離培養(yǎng)結合生化與血清學鑒定）檢測時間長、敏感性差、嚴重影響檢測效率[7-8]。為滿足EHEC O157∶H7快速檢測要求，研發(fā)出了免疫磁珠富集法[9]、生物傳感器法[10-12]、蛋白芯片[13]、基因芯片[14]、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）[15-20]、實時熒光PCR[21-23]和LAMP[24]等檢測方法。其中，PCR方法因檢測快速、靈敏度高，成為主要采用的檢測方法。引物設計是建立有效PCR方法的關鍵因素，常規(guī)的PCR引物設計，不僅需要反復優(yōu)化引物的各項參數(shù)與反應條件，尤其是退火溫度，而且需要反復比對引物的特異性，以防止非特異性擴增，尤其是涉及多重PCR方法設計時，需要大量的實驗以驗證方法的特異性，費時又費力。

雙啟動寡核苷酸引物（dual-priming oligonucleotide，DPO）是一種新型的引物設計方法：DPO引物分為2個部分，即長5’-端（18～25 bp，Tm＞65 ℃）和短3’-端（6～12 bp，GC含量為40%～80%），兩者間用多聚次黃嘌呤連接；基于DPO引物的特殊結構，引物自身以及引物間難形成二級結構且對退火溫度不敏感，實驗過程中不需要對引物進行篩選以及對退火溫度進行優(yōu)化，簡化了引物設計和實驗步驟；擴增時，只要DPO引物5’-端或3’-端有3 個以上堿基發(fā)生錯配，PCR擴增就會終止，有效地阻斷了非特異性擴增，特異性更強[25-28]。本研究利用該技術，建立了EHEC O157∶H7基于DPO引物的PCR檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

本研究所用實驗菌株有：腸出血性大腸桿菌O157∶H7 ATCC 35150、產腸毒素大腸桿菌ATCC 35401、腸侵襲性大腸桿菌ATCC 43893、腸致病性大腸桿菌ATCC 43887、大腸桿菌ATCC 25922、阪崎腸桿菌ATCC 51329、單核細胞增生李斯特氏菌ATCC 19111、嗜水氣單胞菌ATCC 7966、空腸彎曲菌ATCC 33560、變形桿菌ATCC 49027、沙門氏菌ATCC 10708、志賀氏菌ATCC 12022、金黃色葡萄球菌ATCC 29213、小腸結腸炎耶爾森氏菌ATCC 9610、粘質沙雷菌ATCC 14756、肺炎克雷伯氏菌ATCC 10031、霍亂弧菌ATCC 14035、副溶血弧菌ATCC 27519、溶藻弧菌ATCC 33839和創(chuàng)傷弧菌ATCC 33149 美國典型菌種保藏中心（ATCC）；溶血性鏈球菌CMCC 32121 中國醫(yī)學微生物菌種保藏中心（CMCC）；腸出血性大腸桿菌O157∶H7分離株2 株、擬態(tài)弧菌分離株1 株和大腸桿菌分離株2 株由本實驗室分離保存。

1.1.2 試劑

細菌基因組DNA提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司；Taq DNA Polymerase、dNTP、MgCl2日本TaKaRa公司；復合增菌培養(yǎng)基BPW 北京蘭伯瑞生物技術公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計

以腸出血性大腸桿菌O157∶H7 rfbE基因為靶基因，經(jīng)BLAST分析，選取rfbE基因保守區(qū)域設計DPO引物，詳見表1，引物由上海生工生物工程公司合成。

表 1 引物序列Table 1 Primers used in this study

1.2.2 細菌DNA提取

將1.1.1節(jié)中的菌株分別接種于5 mL BPW培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜，取1 mL菌液，利用細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌DNA，－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 DPO-PCR反應體系優(yōu)化

反應體系為25 L：10×PCR Buffer（Mg2+free）2.5 L；Mg2+（25 mmol/L）用量范圍為0.5～5.0 L，以0.5 L遞增；dNTP（2.5 mmol/L for each）用量范圍為0.25～2.5 L，以0.25 L遞增；Taq DNA Polymerase （5 U/ L）用量范圍為0.05～0.5 L，以0.05 L遞增；DPO引物（上、下游各10 mol/L）用量范圍為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0 L；細菌DNA 模板1 L，去離子水補充至25 L。反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，57.5 ℃ 45 s，72 ℃45 s，30 個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果。

1.2.4 DPO-PCR退火溫度不敏感性實驗

將退火溫度范圍設為45～65 ℃，進行DPO-PCR反應，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測其擴增效果，并與常規(guī)PCR引物進行比較。

1.2.5 DPO-PCR靈敏度實驗

將菌體濃度約為9.4×106CFU/mL的EHEC O157∶H7進行10倍梯度稀釋，提取每級稀釋度EHEC O157∶H7的基因組DNA，以此為模板進行DPO-PCR擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測確定檢測靈敏度。

1.2.6 DPO-PCR特異性實驗

利用建立的DPO-PCR方法檢測1.1.1節(jié)所示菌株以及小鼠、雞、鵝和豬腸道細菌（經(jīng)檢測不含EHEC O157∶H7）宏基因組，以驗證本方法的特異性，并與常規(guī)PCR引物進行比較。

1.2.7 方法驗證實驗

將建立的EHEC O157∶H7 DPO-PCR檢測方法應用于檢驗檢疫實踐工作中，以檢驗檢疫行業(yè)標準（SN/T 0973—2010《進出口肉、肉制品及其他食品中腸出血性大腸桿菌O157∶H7檢測方法》）檢測結果作為參照，驗證其可靠性。

2 結果與分析

2.1 EHEC O157∶H7 DPO-PCR檢測方法的建立

以EHEC O157∶H7 rfbE基因為靶基因，設計一對DPO引物，經(jīng)反應體系的優(yōu)化，建立了EHEC O157∶H7 DPOPCR檢測方法，優(yōu)化后的反應體系為（25 L）：10×PCR Buffer（Mg2+free）2.5 L，Taq DNA Polymerase（5 U/ L）0.1 L（圖1A中2泳道），Mg2+（25 mmol/L）2.5 L（圖1B中5泳道），dNTP（2.5 mmol/L）1.5 L（圖1C中6泳道），上、下游DPO引物（10 mol/L）各0.5 L（圖1D中5泳道），DNA模板1 L，去離子水補充至25 L。

圖 1 EHEC O15577∶H7 DPO-PCR檢測方法的建立Fig.1 Development of DPO-PCR method for the detection of EHEC O157∶H7

2.2 DPO-PCR退火溫度不敏感性

退火溫度設為45～65 ℃時，利用DPO引物進行PCR擴增，擴增效率隨著退火溫度的變化基本保持一致，而利用常規(guī)引物進行PCR擴增時，擴增效率隨著退火溫度的升高逐漸增加后下降（圖2），表明DPO引物的退火溫度范圍較寬。

圖 2 DPO引物退火溫度不敏感性Fig.2 Insensitivity of DPO primers to annealing temperature

2.3 DPO-PCR檢測靈敏度

將菌體濃度為9.4×106CFU/mL的EHEC O157∶H7經(jīng)105倍稀釋后，利用建立的DPO-PCR方法仍能有效擴增出目的基因片段（圖3），顯示該DPO-PCR方法檢測EHEC O157∶H7的靈敏度為94 CFU/mL。

M. DNA marker 2000；1. 9.4×106 CFU/mL；2. 9.4×105 CFU/mL;3. 9.4×104 CFU/mL；4. 9.4×103 CFU/mL；5. 9.4×102 CFU/mL；6. 9.4×101 CFU/mL；7. 9.4×100 CFU/mL。

2.4 DPO-PCR檢測特異性

利用建立的DPO-PCR方法檢測1.1.1節(jié)所示細菌以及小鼠、雞、鵝和豬腸道細菌宏基因組，結果顯示：EHEC O157∶H7菌株 （ATCC 35150和2 株分離株）均為DPO-PCR陽性結果，其他為陰性結果，且未見非特異性擴增條帶出現(xiàn)，而利用常規(guī)PCR引物擴增出現(xiàn)了與目的基因片段大小相近的非特異性條帶（圖4），表明本研究建立的EHEC O157∶H7 DPO-PCR檢測方法較常規(guī)PCR特異性更強。

圖 4 EHEC O15577∶H7 DPO-PCR檢測方法特異性結果Fig.4 Specificity of DPO-PCR method for EHEC O157∶H7

2.5 方法實踐驗證

利用建立的EHEC O157∶H7 DPO-PCR檢測方法對228份采集的樣本進行了檢測，共檢測出4份EHEC O157∶H7陽性樣本，經(jīng)檢驗檢疫行業(yè)標準法（SN/T 0973—2010）復檢，兩者檢測結果一致，見表2，顯示該方法具有良好的實用性。

表 2 方法實踐應用Table 2 Detection of EHEC O157 H7 in real samples by the DPO-PCR method

3 結 論

DPO引物與常規(guī)PCR引物相比，設計簡易，不需要對引物參數(shù)進行反復優(yōu)化，在45～65 ℃的退火溫度范圍內，DPO引物均能保持高效率擴增。此外，DPO引物中的次黃嘌呤堿基的氫鍵結合力弱，在DPO引物引導PCR擴增時，如果5'-端或3'-端存在3 個以上堿基錯配，DPO引物便會與DNA模板發(fā)生脫離，終止PCR反應，有效地阻斷非特異性擴增，增加了檢測特異性，而且DPO引物自身以及引物間難形成二級結構，提高了擴增效率。實踐應用證明，本研究建立的EHEC O157∶H7 DPO-PCR檢測方法檢測快速、結果準確，具有良好的實用性。

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