高效液相色譜法測(cè)定辣椒粉中羅丹明B的測(cè)量不確定度評(píng)估

牛 華，牛之瑞*，馮 雷，魯燕驊，馬雪濤，譚建林，張學(xué)忠，俸金梅

（云南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，云南 昆明 650223）

羅丹明B又稱玫瑰紅B，或堿性玫瑰精，俗稱花粉紅，以氧蒽為母體，具有特殊結(jié)構(gòu)及熒光特性。經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其具有高毒、高殘留和致癌、致畸、致突變等特點(diǎn)，歐美、日本等國(guó)家地區(qū)已明令禁止該類物質(zhì)用于食品加工過(guò)程中，2008年我國(guó)衛(wèi)生部將羅丹明B列入《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單（第一批）》明令禁止在食品中添加[1]。

一切測(cè)量結(jié)果都不可避免地具有不確定度。測(cè)量不確定度是對(duì)測(cè)量結(jié)果的正確性或準(zhǔn)確度的“可疑程度”的定量表征，是說(shuō)明測(cè)量質(zhì)量的極其重要的指標(biāo)。我國(guó)已經(jīng)出臺(tái)文件對(duì)校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室測(cè)量不確定度的評(píng)估做出了要求，但目前許多實(shí)驗(yàn)室仍未在檢測(cè)報(bào)告中提供測(cè)量結(jié)果的不確定度[2]。

我國(guó)現(xiàn)行的檢測(cè)食品中羅丹明B檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)只有SN/T 2430—2010《進(jìn)出口食品中羅丹明B的檢測(cè)方法》，采用該方法對(duì)辣椒粉中的羅丹明B進(jìn)行測(cè)定，并評(píng)估不確定度，以期找出影響檢測(cè)結(jié)果的因素，為實(shí)驗(yàn)室類似測(cè)量不確定度評(píng)定工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣椒粉 市售；羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：212041286，純度為97%） 美國(guó)ACCU Stand公司；乙腈、甲醇色譜純；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UFLC-XR高效液相色譜（配熒光檢測(cè)器）、LabSlution工作站 日本Shimadzu公司；凝膠滲透色譜自動(dòng)凈化儀（gel permeation chromatography，GPC）德國(guó)LC-Teach公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取適量羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品0.001 0 g，用甲醇配制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。此溶液在0～4 ℃避光保存。以甲醇配制成相當(dāng)于100 g/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液，再以空白基質(zhì)溶液稀釋成0.5、2.0、4.0 μg/L，供高效液相色譜測(cè)定。

1.3.2 樣品的制備[3]

稱取2 g（精確到0.000 1 g）辣椒粉樣品于25 mL容量瓶中，準(zhǔn)確加入20 mL 乙酸乙酯-環(huán)己烷溶液（1∶1），于旋渦混合器上混合提取2 min，再超聲提取15 min后，定容至25 mL，取上清液過(guò)0.22 μm微孔濾膜后做待凈化液。

取出10 mL待凈化液于凝膠滲透色譜進(jìn)樣瓶，用于凝膠滲透色譜凈化（凝膠滲透色譜實(shí)際進(jìn)樣量為5 mL），收集洗脫液（相當(dāng)于定容至2 mL后，取出1.5 mL），氮吹至近干，殘?jiān)?.0 mL甲醇溶解后，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，供高效液相色譜測(cè)定。

1.3.3 色譜條件

色譜柱為Alltima ODS（150 mm×3.0 mm，4.6 m），柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相：溶劑A為水，溶劑B為乙腈；流量1.0 mL/min；激發(fā)波長(zhǎng)550 nm，發(fā)射波長(zhǎng)580 nm；梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表 1 色譜梯度洗脫條件Table 1 Gradient chromatographic conditions

1.4 數(shù)學(xué)模型的建立與結(jié)果計(jì)算

用外標(biāo)法計(jì)算辣椒粉中羅丹明B的含量，其數(shù)學(xué)模型：

式中：X為辣椒粉樣品中羅丹明B的含量/（μg/L）；C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的樣液中羅丹明B的質(zhì)量濃度/（μg/L）；C0為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的空白實(shí)驗(yàn)中羅丹明B的質(zhì)量濃度/（μg/L）；V為辣椒粉樣品的定容體積/mL；m為最終樣液所代表的試樣質(zhì)量/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制過(guò)程引入的不確定度[4-8]

標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過(guò)程中影響不確定度因素見(jiàn)表2。

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品引入的不確定度

羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品證書(shū)上標(biāo)稱的純度標(biāo)示為97%，由標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的不確定度為：

式中：Urel為相對(duì)不確定度；Cs為標(biāo)準(zhǔn)品的純度；std表示標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程。

2.1.2 天平誤差引入的不確定度

天平允許的最大誤差為±0.01 mg，稱取羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品1.00 mg，取矩形分布，引入相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.1.3 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品引入的不確定度

稀釋標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，使用移液器移取10 μL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中配制成相當(dāng)于100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液（Cm），移液器的允許誤差是8.0%，引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的總不確定度

上述各因素互不相關(guān)，因此，由羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液配制所產(chǎn)生的不確定度為：

2.2 最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線求樣品質(zhì)量濃度時(shí)產(chǎn)生的不確定度[9-13]

采用3個(gè)水平的羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液，用高效液相色譜測(cè)定1次，得到相應(yīng)的峰面積，用最小二乘法進(jìn)行擬合，得到擬合方程y=aC＋b，以及相關(guān)系數(shù)r（表3）。以擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線為定量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)樣品進(jìn)行了4次測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)引入不確定度結(jié)果見(jiàn)表5。

表 2 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過(guò)程中的不確定度Table 2 Uncertainty during standard solution dilution

表 3 線性回歸測(cè)定結(jié)果及擬合方程Table 3 Linear regression and fitted equation

表 4 樣品平行測(cè)定樣品的質(zhì)量濃度（C0）測(cè)量結(jié)果Table 4 Results of parallel measurements

由標(biāo)準(zhǔn)曲線求質(zhì)量濃度時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度由式（6）計(jì)算：

式中：a為工作曲線的斜率；p為樣品平行測(cè)定的次數(shù)；m為標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)測(cè)定的次數(shù)；n為所配標(biāo)準(zhǔn)溶液個(gè)數(shù)；Sy/c為工作曲線的標(biāo)準(zhǔn)偏差；Sc/c為Cij各點(diǎn)的值與之差的總和；Yij為各質(zhì)量濃度點(diǎn)測(cè)定響應(yīng)值；Yi為線性方程計(jì)算響應(yīng)值；C0為樣品平均質(zhì)量濃度。

相對(duì)不確定度：

表 5 最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)引入不確定度Table 5 Uncertainty resulting from least square curve fittingTable 5 Uncertainty resulting from least square curve fitting

2.3 由樣品制備所引入的不確定度[14-21]

2.3.1 天平引入的不確定度

天平校準(zhǔn)允許的最大誤差為±0.000 1 g，稱取辣椒粉2 g，取矩形分布，引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.2 移液管引入的不確定度

使用25 mL（V1）移液管（A級(jí)）允許的最大誤差為±0.030 mL，取矩形分布，由樣品定容體積引入對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的不確定度：

2.3.3 定容引入的不確定度

凈化完畢后，經(jīng)氮?dú)獯蹈傻臉悠愤M(jìn)行定容，使用1 mL（V2）移液管，其允許的最大誤差為0.007 mL，取矩形分布，引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

2.3.4 凝膠滲透色譜凈化過(guò)程回收率產(chǎn)生的不確定度

凝膠滲透色譜凈化過(guò)程回收率所產(chǎn)生的不確定度U（CR）由3次回收率測(cè)量平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差S（CR）計(jì)算所得（表6）：

為了確定回收率是否計(jì)入羅丹明B質(zhì)量分?jǐn)?shù)的計(jì)算中，應(yīng)對(duì)平均回收率進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)：

當(dāng)t大于雙邊臨界值t（95，2）=4.3時(shí)，則回收率R有顯著性差異，回收率應(yīng)用以修正結(jié)果；相反，則不必使用。

表 6 羅丹明B顯著性檢驗(yàn)Table 6 Significance test of rhodamine B

表 6 羅丹明B顯著性檢驗(yàn)Table 6 Significance test of rhodamine B

/% S（CR）/%U（CR）/% Urel（CR）/% t 顯著性差異58.1 5.60 3.23 5.56 1.30 不顯著

2.3.5 由樣品制備過(guò)程引入的總不確定度

上述各因素互不相關(guān)，因此，樣品的前處理過(guò)程的不確定度為：

2.4 測(cè)量不確定度的評(píng)定與報(bào)告

2.4.1 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.4.2 相對(duì)擴(kuò)展不確定度

95%置信水平下，取K=2，則：

2.4.3 擴(kuò)展不確定度

2.4.4 結(jié)果表示

用高效液相色譜法測(cè)定辣椒粉中的羅丹明B，結(jié)果為：

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)各檢測(cè)環(huán)節(jié)不確定度的評(píng)估發(fā)現(xiàn)，不確定度主要來(lái)自由樣品制備的過(guò)程中，而制備過(guò)程中則以凝膠滲透色譜凈化過(guò)程回收率的不確定度影響最大。所以，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程的不確定度控制應(yīng)以控制凝膠滲透色譜凈化過(guò)程回收率的穩(wěn)定性為關(guān)鍵，來(lái)保障檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

[1]全國(guó)打擊違法添加非食用物質(zhì)和濫用食品添加劑專項(xiàng)整治領(lǐng)導(dǎo)小組. 食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單(第一批)[EB/OL]. (2008-12-12). http://www.jswst.gov.cn/gb/jsswst/zxgz/sptjj/userobject1ai21520.html.

[2]中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì). CNAS-CL07: 2011 測(cè)量不確定度的要求[S]. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2011.

[3]國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. SN/T 2430—2010 進(jìn)出口食品中羅丹明B的檢測(cè)方法[S]. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2010.

[4]全國(guó)法制計(jì)量技術(shù)委員會(huì). JJF 1059—1999 測(cè)量不確定度評(píng)定與表示[S]. 北京: 中國(guó)計(jì)量出版社, 1999.

[5]國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. JJG 196—2006 常用玻璃量器檢定規(guī)程[S]. 北京: 中國(guó)計(jì)量出版社, 2007.

[6]國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. JJG 646—2006 移液器檢定規(guī)程[S].北京: 中國(guó)計(jì)量出版社, 2007.

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