液相色譜-四極桿-飛行時間質譜法篩查食品中6 種人工合成甜味劑

王建華，楊 君，劉 琳，顏冬云，李 立，劉靖靖

（1.山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，山東 青島 266002；2.青島大學化學科學與工程學院（環(huán)境科學與工程學院），山東 青島 266071；3.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100123）

甜味劑是一類重要的食品添加劑，按其來源可以分為天然甜味劑和人工合成甜味劑。人工合成甜味劑在人體內不進行代謝吸收、不提供熱量或因用量低產生的熱量少，但甜度高，不僅能夠賦予食品良好的口感，而且還可以取代蔗糖作為糖尿病人和肥胖病人的替代品，因而在廣泛應用于各類食品中[1]。到目前為止，世界各國已獲批準的人工甜味劑有20 種，其中得到多數(shù)國家批準使用的品種主要有安賽蜜、阿斯巴甜、甜蜜素、糖精、三氯蔗糖等[2]。然而科學研究表明，人工合成甜味劑能致使某些動物產生腫瘤[3]，因此為避免其對人體產生潛在危險，限制食品飲料中甜味劑的用量是必要的。美國、歐盟、日本等國對食品中甜味劑的使用有嚴格規(guī)定[4]，中國衛(wèi)生部2011年發(fā)布的GB 2760—2011《食品添加劑使用標準》中也嚴格了規(guī)定甜味劑在不同食品基質中的限量[5]。楊君等[6]綜述了近幾年食品中甜味劑的檢測方法，主要有高效液相色譜法[7-11]、液相色譜-質譜法[12-14]、液相色譜-串聯(lián)質譜法[15-20]、氣相色譜法[21,22]、氣相色譜-質譜法[23]、毛細管電泳-電導法[24]、分子吸收分光光度法[25]等。

四極桿-飛行時間質譜（quadrupole-time-of-f i ght mass spectrometry，Q-TOF-MS）屬于高分辨質譜，可根據(jù)化合物離子的精確分子質量對其進行準確定性分析，它獲得的全掃描譜圖可以用于建立化合物質譜數(shù)據(jù)庫，因此在沒有標準品的情況下也可對未知樣品中的化合物進行準確定性。目前國內沒有使用高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜（high performance liquid chromatography-Q-TOF-MS，HPLC-Q-TOF-MS）檢測食品中甜味劑的報道，而國外已有報道使用該技術檢測食品中3 種甜味劑[3]。因此本研究通過優(yōu)化前處理條件、色譜和質譜條件，首次建立了HPLC-QTOF-MS同時檢測固體食品中安賽蜜（acesulfame-K）、糖精鈉（sodium saccharin）、甜蜜素（cyclamate）、三氯蔗糖（sucralose）、阿斯巴甜（aspartame）、紐甜（neotame）6種常用人工合成甜味劑的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈、甲酸、乙酸銨、甲酸銨（均為色譜純）美國Honeywell Burdick & Jackson Muskegon公司；實驗室用水由Milli-Q純水系統(tǒng)制備；糖精鈉、甜蜜素、安賽蜜、阿斯巴甜、紐甜、三氯蔗糖（純度均為99.0%）德國Dr. Ehrenstorfer公司。

1.2 儀器與設備

1200高效液相色譜儀、6520 Accurate Mass Q-TOF LC-MS、Eclispe XDB-C18色譜柱、Eclispe plus-C18美國Agilent公司；3-18K臺式冷凍離心機 美國Sigma公司；PL303電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KQ-500DB數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

稱取標準品各0.050 0 g于50 mL棕色容量瓶中，用純水溶解并定容，配制成1 mg/mL的混合標準儲備液，置于冰箱中4 ℃（可保存1 個月）。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Eclispe XDB-C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，5 μm）；流動相A甲醇；流動相B 0.1%甲酸-10mmol/L甲酸銨溶液；梯度洗脫程序：0～1.0 min，98% B；1.0～5.0 min，98%～20% B；5.0～7.0 min，20%B；7.1 ～20.0 min，98% B；流速：0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量5 μL。

1.3.3 質譜條件

電噴霧源離子源；負離子模式；干燥氣溫度3 5 0 ℃；干燥氣流速1 2 L/m i n；霧化氣壓力348.3 kPa （50 psi）；毛細管電壓4 000 V；錐孔電壓140 V；參比離子m/z 121.985 6、1 033.988 1；質量掃描范圍m/z 100～1 100。

1.3.4 樣品處理

準確稱取經均質的樣品1.0 g至50 mL容量瓶中，加入20 mL純水，超聲500 Hz提取10 min，用純水定容至刻線，搖勻后將樣品轉入離心管中，以7 000 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm尼龍濾膜，濾液供測定。

1.3.5 基質效應計算

基質是樣品中被分析物以外的組分，常對分析物的分析有顯著干擾，并影響分析結果的準確性，這些影響和干擾被稱為基質效應[26]。為研究甜味劑在不同基質中的基質效應，實驗選取4 類基質，配制成不同質量濃度（0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L）的基質標準溶液及溶劑標準溶液，分別建立標準曲線，比較2 條標準曲線斜率的差異，從而判斷基質效應的強弱。

基質效應/%=（1－B/A）×100

式中：A為溶劑標準曲線的斜率；B為基質標準曲線的斜率。

2 結果與分析

2.1 前處理方法優(yōu)化

固體樣品的提取溶劑主要有純水[7-8]、甲醇-水[9,12,17]、流動相[11,13]等，提取方法有超聲提取[7,9,12-13,17]、微波提取[8]等。由于實驗所研究的6 種甜味劑均可溶于水，因此采用純水超聲提取的方法。多數(shù)文獻采用提取液直接過0.22 μm微孔濾膜凈化的方法，只有少數(shù)研究[7,10]采用固相萃取法（solid phase extraction，SPE）凈化，而本實驗采用SPE凈化樣品時效果不佳，故采用提取液直接過0.22 μm微孔濾膜的方法凈化。

對固體樣品進行分析一般需要均質，才能使待測物質更充分地被提取出。本實驗比較了均質和不均質對含有甜蜜素和糖精鈉的陽性樣品提取效率的影響，按照1.3.4節(jié)所述方法進行提取，經均質的樣品中甜蜜素含量為1 023.7 mg/kg，糖精鈉含量為165.5 mg/kg；未經均質的樣品中甜蜜素含量為222.7 mg/kg，糖精鈉含量為44.6 mg/kg。這說明甜味劑已浸入樣品內，不均質的樣品中甜味劑沒有被完全提取出來，因此固體樣品檢測需要經過均質。

2.2 色譜和質譜條件的優(yōu)化

由于固體樣品成分復雜，因此本實驗對色譜柱和流動相進行了詳細的考察。分別考察了Eclispe XDB-C18和Eclispe plus-C182種色譜柱，結果發(fā)現(xiàn)在Eclispe XDB-C18色譜柱上6 種化合物的分離效果和峰形更好、靈敏度更高。

對流動相體系進行了優(yōu)化，考察了0.1%甲酸-10 mmol/L乙酸銨溶液-甲醇和0.1%甲酸-10 mmol/L甲酸銨溶液-甲醇體系，發(fā)現(xiàn)0.1%甲酸-10 mmol/L甲酸銨溶液-甲醇體系分離響應高、峰形好，故選作為流動相。對同一濃度標準溶液采用不同梯度洗脫程序進行分析，最終優(yōu)化的梯度洗脫程序的分析靈敏度比其他洗脫程序高10.5%～23.4%，故采取1.3.2節(jié)的梯度洗脫程序進行試樣分析。

圖 1 正、負模式下化合物響應值的比較Fig.1 Comparison of the responses of target compounds in positive and negative modes

分別采用正、負離子模式進行全掃描，由圖1可見，三氯蔗糖、阿斯巴甜、紐甜在正、負模式下均有響應，且正模式的響應要比負模式強；而安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素3 種化合物在正模式下沒有響應，因而采用負離子模式進行檢測。

在Q-TOF-MS檢測中，錐孔電壓是一項關鍵參數(shù)，通過優(yōu)化使目標化合物有較高的靈敏度和較少的碎片離子。本實驗優(yōu)化了90～200 V的錐孔電壓，以阿斯巴甜為例，其裂解途徑和質譜圖見圖2，分子離子峰[M—H]－（m/z 293.113 8）在高、中、低3 個電壓條件下（90、140、200 V）均會產生碎片[M—H—O—CH4]－（m/z 261.087 5）和[M—H—C6H5—CH3]－（m/z 200.043 3）。當電壓為90 V時產生的分子離子峰和碎片離子的響應值較低，200 V時產生的雜峰較多，不利于定性分析，實驗發(fā)現(xiàn)響應值隨著錐孔電壓的增加，各甜味劑的響應值逐漸升高，到達某一電壓時最高；再升高電壓時，響應值降低或不變，經綜合考慮選擇140 V作為最佳錐孔電壓。

圖 2 阿斯巴甜在90（A）、140（B）、200（C）V錐孔電壓下的質譜圖及裂解途徑圖（D）Fig.2 TOF-MS spectra and fragmentation elucidation of aspartame

本實驗還對干燥氣流速、霧化氣壓力、干燥氣溫度進行了單因素優(yōu)化。在0.3 mL/min流速下，研究了不同的干燥氣流速對響應值的影響，結果見圖3。實驗表明，對于所研究的6種甜味劑，氮氣流速過低時響應值較差，大部分甜味劑在氮氣流速為10～13 L/min時質譜響應值達到最高，故經過綜合考慮實驗將干燥氣流速設置為12 L/min。

圖 3 干燥氣流速對霧化效果的影響Fig.3 Effect of drying air flow rate on the nebulization

在干燥氣流速為12 L/min時，研究了不同霧化氣壓力對霧化效果的影響，結果見圖4。實驗表明，噴霧壓力對質譜響應值有一定影響，大部分甜味劑在噴霧壓力為50～60 psi時質譜響應值較高，故經綜合考慮將霧化氣壓力設為50 psi。

圖 4 霧化氣壓力對霧化效果的影響Fig.4 Effect of nebulizer gas pressure on the nebulization

圖 5 干燥氣溫度對霧化效果的影響Fig.5 Effect of drying air temperature on the nebulization

由圖5可知，質譜信號隨著干燥氣溫度的上升而增強，到達一定溫度后不再上升，這是因為本實驗的研究對象為水溶性化合物，色譜分離時使用的水相比例較高，因此需要較高的干燥氣溫度進行霧化，結合儀器的實際情況及響應值，將干燥氣溫度設置為350 ℃。

在優(yōu)化好的色譜和質譜條件下對6 種甜味劑進行分析，分子離子峰精確分子質量的理論值和測量值以及偏差見表1，分子特征離子提取色譜圖及質譜圖見圖6。

表 1 各化合物理論分子質量、實測分子質量和匹配結果Table 1 Calculated mass and experimental mass measurements of molecular ions of the target compounds

圖 6 6種甜味劑的提取離子色譜圖及其質譜圖Fig.6 Extracted ion chromatograms and mass spectra of 6 sweeteners

2.3 目標化合物的定性分析

結合甜味劑自身分子結構和電噴霧負離子模式去H的機理，根據(jù)分子離子峰精確分子質量的理論值與測量值的質量偏差小于5 ppm以及特征碎片離子，可對該化合物進行準確定性。

通過二級質譜圖可進一步獲得母離子的特征碎片離子的精確分子質量。在負離子模式下，進行一級質譜圖掃描，得到母離子的精確分子質量，再對母離子進行二級質譜圖掃描，得到母離子碎片特征離子的精確分子質量。由圖2可知，阿斯巴甜一級圖譜母離子的精確分子質量為293.113 8，二級圖譜的2個特征離子的精確分子質量為261.087 5和200.043 3。母離子293.113 8到子離子261.087 5丟失的碎片離子的分子質量為32.026 3，剛好為—OCH4的分子質量，由此可知在電噴霧電離源作用下，阿斯巴甜在烷氧基鍵處易斷裂。安賽蜜的母離子（分子質量為161.986 1）失去—OSO2得到分子質量為82.030 3的碎片離子，再進一步失去2個H得到分子質量為77.965 5碎片離子；糖精鈉的母離子（分子質量為181.991 1）失去苯環(huán)得到分子質量為105.960 0的碎片離子；甜蜜素母離子失去—C6H12得到分子質量為79.957 5的碎片離子；三氯蔗糖由于帶有—Cl，其母離子失去—Cl得到分子質量為359.0242的碎片離子，進一步失去—OCH，得到分子質量為330.977 1的碎片離子；紐甜斷裂—OCH4得到分子質量為345.181 3的碎片離子。表2列出了各甜味劑二級質譜的理論、實測分子質量及碰撞能量。

表 2 各化合物二級質譜的理論分子質量、實測分子質量、匹配結果及碰撞能量Table 2 Calculated mass and experimental mass measurements of molecular ions of the target compounds in MS-MS mode

實驗對6種甜味劑分別建立了精確分子質量數(shù)據(jù)庫和譜圖庫。精確分子質量數(shù)據(jù)庫包括化合物的名稱、分子式、精確分子質量及保留時間。通過分子離子峰精確分子質量的理論值與測量值的質量和保留時間對樣品中的甜味劑進行檢測。譜圖庫包括化合物所有碎片離子信息，可通過實際測定樣品的譜圖與譜庫中碎片離子信息的鏡像比對對甜味劑進行定性確證。

分別采用標準溶液和基質標準溶液對本實驗建立的精確分子質量數(shù)據(jù)庫和譜圖庫進行驗證，標準溶液和基質標準溶液與精確分子質量數(shù)據(jù)庫和譜圖庫的匹配率的得分超過70分的甜味劑比例均超過97%。結果表明2個數(shù)據(jù)庫的準確性良好，可以應用到實際樣品的篩查過程中。

2.4 基質效應評價

表 3 6種甜味劑在果脯、餅干、肉類及糖類中的基質效應Table 3 Matrix effects of 6 sweeteners in preserved fruit, biscuits,meat and candy%

如表3所示，4種基質中安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖均為基質增強效應，只有阿斯巴甜或紐甜會出現(xiàn)基質抑制效應。不同固體樣品體現(xiàn)了不同的基質效應，并且甜味劑以基質增強效應為主。由于基質效應明顯，本方法最終采用基質匹配外標校準曲線對樣品中的甜味劑進行定量，以抵消基質效應的影響。

2.5 線性關系、回收率、精密度及定量限

表 4 6種人工甜味劑的線性方程、相關系數(shù)、添加回收率、精密度及定量限Table 4 Linear equations, correlation coefficients, recoveries,precisions and limits of quantification (LOQ) of 6 synthetic sweeteners

將陰性餅干樣品按1.3.4節(jié)方法處理，配成0.02～2.0 mg/L質量濃度范圍內的基質標準溶液。由表4可見，基質標準溶液的質量濃度x與峰面積y呈良好的線性關系，相關系數(shù)均大于0.998。

通過向陰性的餅干和調味黃瓜樣品中添加0.5 mg/L的甜味劑混合標準溶液測定回收率和精密度，每個樣品平行分析5次。由表4可見，回收率在74.5%～120.1%之間，相對標準偏差（RSD）為0.9%～10.4%。

2.6 實際樣品的測定

根據(jù)已建立的數(shù)據(jù)庫，對各類市售食品中的甜味劑進行譜圖庫確證，得到固體大麥茶、葡萄干、調味黃瓜、點心的碎片離子圖，與數(shù)據(jù)庫的譜圖鏡像對比不符，確定其中不含所測的甜味劑。采用基質匹配外標校準曲線對篩查出的甜味劑進行定量，西梅中糖精鈉含量為151.9 mg/kg、甜蜜素為1 083.2 mg/kg；蟹肉棒中糖精鈉含量為1.3 mg/kg、甜蜜素為2.7 mg/kg；白砂糖中糖精鈉含量為111.6 mg/kg、甜蜜素為325.3 mg/kg；紅油金針菇中安賽蜜含量為143.8 mg/kg；綠茶梅中糖精鈉含量3.8 mg/kg、甜蜜素為82.4 mg/kg、三氯蔗糖為360.9 mg/kg、阿斯巴甜為128.1 mg/kg、紐甜為33.8 mg/kg；燕麥片中阿斯巴甜含量為534.7 mg/kg。以上結果均滿足GB 2760—2011規(guī)定的各類食品中甜味劑的限量要求。

3 結 論

建立了食品中糖精鈉、甜密素、安賽蜜、阿斯巴甜、紐甜、三氯蔗糖6 種人工合成甜味劑的高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯(lián)質譜快速分析方法，優(yōu)化了固體樣品前處理方法和質譜條件，建立了四極桿-飛行時間質譜的精確分子質量定性的譜庫。本方法簡便快捷，靈敏度可滿足現(xiàn)行法規(guī)的限量要求，可為食品安全監(jiān)管提供有效保障。

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