應用PE N3型電子鼻傳感器快速檢測食源性致病菌

陳麗萍，徐茂琴，何紅萍，李 曄,*

（1.寧波大學海洋學院，浙江 寧波 315211；2.寧波城市職業技術學院，浙江 寧波 315100）

隨著經濟全球化進程的加快，由食源性致病菌導致的食品安全問題不斷出現。據報道，全球每年發生40～60億例食源性疾病[1]。細菌污染是影響食品質量和安全的主要因素，由其引起的食源性疾病的暴發嚴重損害人體健康。隨著現代食品安全控制技術如危害分析關鍵控制點（hazard analysis critical control point，HACCP）、微生物危險性評估（microbio 1ogical risk assessment，MRA）的發展等，建立和完善一套微生物快速定量檢測技術，顯得尤為重要[2]。

目前常用的細 菌檢測方法大致包括目前常用的細菌檢測方法大致包括分離培養鑒定法、生化鑒定法、免疫學方法、DNA雜交和定量聚合酶鏈式反應（quantitative polymerase chain reaction，QPCR）等方法[3-4]。傳統的細菌檢驗方法靈敏度高、費用低，但檢測所需時間較長且工作量龐大?，F代免疫學和分子生物學特異性好效率高，但一般樣品預處理過程比較復雜，且較難達到實時檢測的目的[5]。

PEN3型便攜式電子鼻傳感器是一種新穎的分析、識別和檢測手段。其根據對不同樣品的氣味信息進行簡單的比對分析，通過采集標樣信息建立數據庫，再利用化學計量學的統計分析方法對未知樣品進行定性和定量分析，具有快 速、便捷的特點，其工作原理類似人的鼻子，也稱之為“電子鼻”[6]。應用電子鼻檢測，樣品處理方便，操作簡單快捷、有望實現實時檢測。鄧高燕等[7]利用電子鼻技術對兩種細菌在菌株水平上揮發性代謝產物進行研究，表明利用電子鼻進行區 分和鑒定具有一定的可行性。胥勛濤等[8]利用自己開發的氣味濃縮電子鼻提高了兩株病原菌的區分能力，表明電子鼻技術在微生物快速檢測上具有應用潛力。喻勇新等[9]利用電子鼻技術檢測普通過 夜培養后的3 種細菌培養液，Concina等[10]將其應用到加工番茄中的微生物污染檢測。目前化學傳感器的在食品中的應用主要集中在果蔬成熟度和貯藏期的檢驗[11-12]、奶制品的摻假檢驗[13-14]、油脂的檢測[15-16]、以及谷物的貯藏檢驗等[17]。

金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、大腸桿菌（Escherich coli）、糞鏈球菌（Fecal streptococcus）、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）是4 種常見的食源性致病菌。從生物分類學角度上看，這4 種致病菌歸于4 種不同的屬，依次分別為葡萄球菌屬、腸桿菌屬、鏈球菌屬和李斯特菌屬，4 者在基因序列以及代謝表型上均有差別，不同菌株對培養液的利用也存在差異性，從而其揮發性代謝產物也必然是不同的[18]。本實驗依據PEN3型電子鼻傳感器對不同食源性致病菌代謝揮發物質的差異響應，研究應用PEN3型電子鼻傳感器快速檢測區分不同食源性致病菌的可行性。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養基

金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）ATCC 29213、大腸桿菌（Escherich coli）ATCC 25922、糞鏈球菌（Streptococcus fecal）ATCC 29212、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）ATCC 19111 青島高科園海博生物技術有限公司。

LB液體培養基：5 g/L酵母提取物、10 g/L 胰蛋白胨、5 g/L氯化鈉，培養基配制好后經過121 ℃高壓濕熱滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

PEN3型便攜式電子鼻傳感器 德國Airsense公司；QYC-200型恒溫搖床 上海比朗儀器有限公司；BYY-300型培養箱 寧波江南儀器廠；732N可見分光光度計上海精密科學儀器有限公司；SW-CJ-1F單人雙面超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品菌液的制備

將各菌種活化后分別挑取單菌落，接種于裝有100 mL LB培養液的250 mL三角瓶中，置于37 ℃，120 r/min搖床培養過夜作為原始菌液，菌落數約為108CFU/mL，保存備用。

采用梯度稀釋法，用無菌培養液分別將原始菌液稀釋103、105倍和107倍得到樣品菌液（對應菌落數分別為105、103CFU/mL和10 CFU/mL），各取0.5 mL分裝到10 mL的傳感器樣品瓶中，進行傳感器檢測。

吸取1 mL原始菌液加入25 mL培養液中，于37 ℃，120 r/min恒溫搖床上培養，分別于0、2、4、6、8、10 h準確吸取0.5 mL培養后的菌液進行PEN3型電子鼻傳感器檢測。

1.3.2 電子鼻傳感器原理及檢測

PEN3型電子鼻傳感器是由10 種金屬氧化物半導體型（metal oxide semiconductor，MOS）化學傳感元件組成，每型傳感元件所對應的主要敏感物質類型有一定的區別（表1）。PEN3主要通過運行一個改進過的解吸單元，具有自動調整、自動校準及系統自動富集的功能，其主要原理是利用傳感器和氣體相互作用，發生氧化還原反應，從而使傳感器活性材料的導電性發生變化，以電路中電阻的變化值進行信號輸出[6]。傳感器的響應信號即為傳感器接觸到樣品揮發性物質后的電導率G與傳感器在經過標準活性炭過濾氣體后的電導率G0的比值。不同菌液在不同條件下有不同的代謝產物，在傳感器上呈現不同的氣味感應信號。

表 1 化學傳感器及其對應的敏感物質類型Table 1 Chemical sensors corresponding to different types of volatile substances

準確吸取樣品菌液0.5 mL于樣品瓶中，25 ℃恒溫環境中運用PEN3型便攜式電子鼻傳感器對樣品菌液進行檢測。傳感器信號在90 s后基本穩定，選定信號采集時間為100 s。每組樣品菌液分別做3 次平行重復。

1.4 數據分析

選取化學傳感器檢測第100秒的測量數據進行統計分析。運用R For Windows對傳感器的響應信號進行傳感器響應聚類分析，PEN3型傳感器配套的 Winmuster軟件對數據進行主成分分析（principal component analysis，PCA）及線性判別分析（ linear discriminant analysis，LAD）。

2 結果與分析

2.1 傳感器的信號響應

PEN3型電子鼻傳感器中10 種金屬 氧化物半導體型化學傳感元件對不同細菌樣品的檢測反應可得到響應曲線和雷達圖（圖1）。從檢測樣品的傳感器響應曲線中可以得到各個菌株樣品傳感器信號隨時間的變化趨勢。各菌株不同培養時間，不同濃度的揮 發性物質各不相同，故10 種化學傳感元件對不同氣味有不同的響應，信號的相對強弱可通過雷達圖形狀的差異可反映出來。

圖 1 10 個傳感元件對大腸桿菌培養2 h后樣品的響應曲線（A）和 雷達圖（B）F ig.1 Response curves (A) and radar chart (B) of ten sensors for E. coli cultured for 2 h

2.2 傳感器響應的聚類分析

圖 2 10 種傳感元件響應值的聚類區分Fig.2 Cluster analysis of the response values from ten sensors

由圖2可知，化學傳感器的10 型傳感元件（M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8、M9、M10）對不同菌株的各自響應之間存在明顯差異，表明不同樣本之間的揮發物質存在較大差異。

根據響應 值判斷，M4型傳感元件（主要對氫氣有選擇性）在不同菌株與培養基之間的響應值較為接近，M2型傳感元件（靈敏度大，對氮氧化合物很靈敏）的各個響應值之間區別較大。根據響應值的不同，PEN3的10 種傳感器元件在金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、糞鏈球菌、單增李斯特菌等4 種菌和空白培養基的響應可聚為3 類：M2一類，M1、M7、M9一類，M3、M4、M5、M6、M8、M10這6個傳感器元件為一類。說明不同傳感 元件對菌株 和培養基的代謝產物氣味之間存在一定程度的關聯度。

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、糞鏈球菌、單增李斯特菌和空白培養基在不同傳感器元件上的響應值存在差異，根據響應值可聚為3 類：單增李斯特菌和大腸桿菌聚一類，空白培養基一類，糞鏈球菌和金黃色葡萄球菌為一類。表明細菌與培養基之間的區別可用傳感器表征，但是不同菌株之間存在一定的聚類性，需要進一步進行區別驗證。

2.3 不同菌株穩定時期的響應區分

圖 3 不同細菌穩定期時的PCA分析（A）和LDA分析（B）Fig.3 PCA analysis (A) and LDA analysis (B) of different bacteria at the stationary growth stage

PCA是將提取的傳感器響應信號進行數據轉換和降維，并對降維后的特征向量進行線性分類，PC1和PC2上包含了在PCA轉換中得到的第1主成分和第2成分的方差貢獻率。方差貢獻率越大，說明此主要成分可以較好的反映原來多指標的信息。一般情況下，總貢獻率超過70%～85%的方法即可使用[14]。LDA將樣品信號數據通過運算法則投影到某一方向，注重樣品在空間中的分布狀態及彼此間的距離分析，可以使組間變異與組內變異的比率最大。

基于Winmuster軟件將傳感器采集到的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、糞鏈球菌、單增李斯特菌4株菌信號采用PCA和LDA法建立細 菌穩定期時的響應模型，如圖3所示。大腸桿菌、糞鏈球菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌4 株樣本的分析數據點均分布于各自區域，沒有重疊， 并且它們之間的距離較大。PC1、PC2的方差貢獻率分別為86.66%和10.79%，PC1、PC2的總貢獻率為97.45%，LD1、LD2的方差貢獻率分別為62.61%和29.64%，LD1、LD2的總貢獻率為92.25%，這說明這4 株細菌與空白培養基之間的揮發性氣味有較大差異，PEN3型電子鼻傳感器能夠準確地識別出不同細菌的特征氣味，采用PCA和LDA方法能對其進行較好的區分。

2.4 不同培養時間下菌株的傳感器響應

表 2 不同培養時間4 種菌株PCA和LDA分析的方差貢獻率Table 2 Variance contribution of four bacteria cultured for different times by PCA analysis and LDA analysis

圖 4 不同 培養時間金黃色葡萄球菌的PCA區分（A）和LDA區分（B）Fig.4 PCA analysis (A) and LDA analysis (B) of Staphylococcus aureus at different culture times

圖 5 不同培養時間下大腸桿菌的PCA區分（A）和LDA區分（B）Fig.5 PCA analysis (A) and LDA analysis (B) of E. coli at different culture times

圖 6 不同培養時間糞鏈球菌的PCA區分（A）和LDA區分（B）Fig.6 PCA analysis (A) and LDA analysis (B) of Streptococcus fecal at different culture times

圖 7 不同培養時間下單增李斯特菌的PCA區分（A）和LDA區分（B）Fig.7 PCA analysis (A) and LDA analysis (B) of Listeria monocytogenes at different culture times

將接種搖床培養2、4、6、8、10 h后的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、糞鏈球菌、單增李斯特菌進行PCA和LDA分析，如圖4～7所示，各菌株的方差貢獻率如表2所示。不同培養時間細菌的數據點的方差總貢獻率均大于85%。在PCA和LDA區分度下，經過不同培養時間的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、糞鏈球菌、單增李斯特菌各自位于一定的區域范圍，不同菌株區分度明顯，沒有出現重疊且貢獻率較高。

不同種類的細菌菌體所含的酶系統不同，其分解能力不同，從而其代謝產物不同。同時，由于細菌生長要經歷遲緩期、對數期、穩定期、衰退期4 個階段，所以對同一細菌的不同生長階段，揮發物的濃度也有差異[5]。也就是說在同樣的培養基中培養一定時間后，對營養基質的利用情況和所產生的產物就會不同。檢測表明使用PEN3型電子鼻傳感器可以根據氣體成分的差異而將不同時期的細菌進行區分。

2.5 傳 感器對不同濃度細菌的響應區分

圖 8 不同稀釋濃度金黃色葡萄球菌的PCA（A）和LDA（B）區分Fig.8 PCA analysis (A) and LDA analysis (B) of Staphylococcus aureus at different concentrations

圖 9 不同稀釋濃度大腸桿菌的PCA（A）和LDA（B）區分Fig.9 PCA analysis (A) and LDA analysis (B) of E. coli at different concentrations

圖 10 不同稀釋濃度糞鏈球菌的PCA（A）和LDA（B）區分Fig.10 PCA analysis (A) and LDA analysis (B) of Streptococcus fecal at different concentrations

圖 11 不同稀釋濃度單增李斯特菌的PCA（A）和LDA（B）區分Fig.11 PCA analysis (A) and LDA analysis (B) of Listeria monocytogenes at different concentrations

將處于生長穩定期的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、糞鏈球菌、單增李斯特菌4 種菌的原始菌液分別稀釋103、105、107倍（對應菌落數為105、103、10 CFU/mL）后進行PEN3型電子鼻傳感器檢測，并進行PCA和LDA分析，結果如圖8～11所示。在所建的模型中，不同濃度的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、糞鏈球菌、單增李斯特菌各自分析數據點均分布于各自區域，沒有重疊。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、糞鏈球菌、李斯特菌4 種菌的各自不同濃度的菌液在PCA圖上都能夠很好的區分開，區分度較為集中，主要在PC1和LD1上，這表明傳感器對細菌的響應較為靈敏，主成分分析和線性判別分析的區分度較強。根據穩定時期不同濃度細菌產生的代謝揮發性物質的濃度不同，基于PEN3型電子鼻傳感器的靈敏性，在建立不同細菌的指紋圖譜基礎上，可進一步研究了其對低濃度細菌的識別能力。

3 結 論

基于金屬氧化物的PEN3型電子鼻傳感器技術對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、糞鏈球菌、單增李斯特菌4 種食源性致病菌培養液的揮發性代謝產物進行檢測，PCA、LDA均可建立4種菌的指紋圖譜，并將4 種致病菌株明顯區分開，在原始菌液稀釋107倍后（對應菌落數約10 CFU/mL）的較低濃度下仍能區分開。這說明基于氣味指紋的PEN3型電子鼻傳感器技術具有區分不同微生物的潛在能力，有望在致病菌快 速檢測和鑒定方面進一步得到應用。但具體的特征性揮發性成分組成可進一步結合儀器如GC-MS、GC-O等進行檢測[19-22]。

相對于傳統的微生物檢測方法[23-25]，PEN3型電子鼻傳感器檢測主要針對于微生物的揮發性代謝產物，對樣品沒有特殊的要求，操作簡單，費時短靈敏度高，最重要的是在操作過程中不需要對樣品進行任何破壞處理，這在微生物快速檢測中是一項非常有發展前景的無損傷快速檢測方法，有望在食源性致病菌的低濃度快速檢測和鑒定方面進一步得到利用。

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