斑馬魚對3種氯酚的富集作用及其SOD酶活性應激反應研究

宋志慧，孫欣欣，李捍東

1.環境基準與風險評估國家重點實驗室，中國環境科學研究院，北京 100012

2.青島科技大學環境與安全工程學院，山東青島 266042

斑馬魚對3種氯酚的富集作用及其SOD酶活性應激反應研究

宋志慧1，2，孫欣欣2，李捍東1*

1.環境基準與風險評估國家重點實驗室，中國環境科學研究院，北京 100012

2.青島科技大學環境與安全工程學院，山東青島 266042

為了研究對氯酚（4-CP）、2，4-二氯酚（2，4-DCP）、2，4，6-三氯酚（2，4，6-TCP）對斑馬魚的生理毒性作用，以7 d富集系數（KBCF）和超氧化物歧化酶（SOD）活性為評價指標，采用半靜態試驗法對斑馬魚進行馴養和試驗，測定斑馬魚對3種氯酚的7 d KBCF，同時測定不同濃度條件下，暴露1 d和7 d，斑馬魚體內SOD酶活性。結果表明，4-CP、2，4-DCP和2，4，6-TCP的7 d KBCF分別為33.65±5.29、65.54±10.49和128.05±39.83，富集能力表現為4-CP（無富集）＜2，4-DCP（輕度富集）＜2，4，6-TCP（輕度富集）；斑馬魚對氯代酚類物質的富集性與氯酚類物質氯原子取代個數正相關。3種氯酚脅迫斑馬魚結果表明，暴露1 d表現為誘導－抑制效應，暴露7 d表現為抑制效應，酶活性變化顯著。

斑馬魚；對氯酚；2，4-二氯酚；2，4，6-三氯酚；超氧化物歧化酶

隨著我國經濟的快速發展，工業廢水和城市生活污水排放日益增多，生態環境壓力越來越大。由于氯酚類化合物（chlorophenols，CPs）廣泛應用于木材防腐、農業化學品、生物殺傷劑、染料、殺真菌劑和一般殺蟲劑［1］等工農業產品的加工制造中，已成為水環境污染的主要污染物之一。研究發現，含有CPs的廢水占我國工業廢水總量的16%左右。CPs無疑是芳香族化合物中用途最廣、毒性較大、污染較嚴重的一類化合物［2-3］。歐盟和美國國家環境保護局（US EPA）已將五氯酚（PCP）、2，4-二氯酚（2，4-dichlorophenol，2，4-DCP）和2，4，6-三氯酚（2，4，6-trichlorophenol，2，4，6-TCP）列為優先監測有機污染物之一［4］。該類物質在環境中具有高毒性、持久性以及難降解等特性，因此備受環保工作者的關注。

CPs可導致魚類、軟體動物以及哺乳動物的內分泌紊亂、免疫力下降和機體功能失調［5-6］，進而通過生態系統食物鏈和生物富集作用［7-9］，危害人體健康。近年來基于三苯基錫、五氯酚和重金屬等物質暴露條件下，對水生生物的過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）以及斑馬魚（Zebrafish）早期胚胎生理發育影響的研究［10-16］有大量報道，但是對氯酚類物質脅迫斑馬魚的超氧化物歧化酶（SOD）卻少有研究。因此筆者選用對氯酚（4-chlorophenol，4-CP）、2，4-DCP和2，4，6-TCP對斑馬魚進行毒性暴露試驗，研究斑馬魚的7 d毒性富集作用和3種氯酚對斑馬魚SOD酶活性的影響，以7 d富集系數（KBCF）和超氧化物歧化酶（SOD）酶活性為評價指標，將生物學科的生理生化指標引入環境毒理學研究中，評價污染物對環境的影響，以期為水生生態毒理學研究和政府部門制定各種水質標準和污染物排放標準提供理論數據支持。

1 試驗

1.1 受試材料

以斑馬魚為試驗材料。作為國際標準化組織（ISO）推薦的試驗魚種［17］，斑馬魚體型較小、來源方便、不受季節限制，其基因與人類基因相似程度達87%。試驗用魚購自北京某市場，魚體長2.4～3.3 cm，體質量100～348 mg，雌雄各半，實驗室馴養12 d，馴養條件滿足GB/T 13267—1991《化學品測試方法》中203魚類急性毒性試驗［18］要求（間隔12 h光照，溫度21～25℃，溶解氧濃度大于80%）。以重鉻酸鉀為參比物，在24 h試驗期間K2CrO7的LC50（半數致死濃度）為200～400 mg/L，敏感性試驗得出K2CrO7對斑馬魚暴露24 h LC50為367.85 mg/L，即Cr6＋對斑馬魚的24 h LC50為130.01 mg/L，結果滿足標準規定的濃度范圍，因此該批斑馬魚可用于毒性試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計

先按照GB/T 13267—1991中魚類急性毒性試驗要求進行急性毒性試驗，根據預試驗結果，在包括魚全部死亡的最低濃度和48 h魚全部存活的最高濃度間，按照幾何級數［19］，濃度梯度間隔系數≤2.2，劃分5個濃度組（4-CP濃度為2.0、4.0、6.0、8.0、11.0 mg/L；2，4-DCP濃度為1.0、2.5、4.0、5.5、7.0 mg/L；2，4，6-TCP濃度為1.0、1.3、1.5、1.7、1.9 mg/L），并設置空白和助溶劑對照（以丙酮為溶劑，以染毒物為溶質配置母液，再量取一定母液分別稀釋到相應濃度，根據計算最大濃度組助溶劑使用量均為0.1 mL/L，滿足助溶劑使用量標準要求體積比≤0.1 mL/L），連續試驗96 h，重復試驗3次。

1.2.2 7 d富集試驗

毒性暴露試驗：根據急性毒性試驗結果，參照《化學農藥環境安全評價試驗準則》，以3種氯酚對斑馬魚的96 h LC50為基準，分別選擇其1/3作為富集試驗暴露濃度，用事先配置好的母液按富集試驗暴露濃度分別配置4-CP（2.158 mg/L）、2，4-DCP（1.442 mg/L）、2，4，6-TCP（0.357 mg/L）染毒液。各取200 mL染毒液于250 mL燒杯，每個燒杯放入2條斑馬魚（斑馬魚平均質量89.5 mg，最大承載量為1.0 g/L），同時進行空白和助溶劑對照試驗，每24 h更換1次染毒液，期間不喂食，觀察魚的生理情況。恒溫培養箱持續暴露7 d后，斑馬魚低溫冷凍殺死，吸干體表水稱重，于冰箱冷凍層保存。

毒性測定：1）樣品預處理，從冰箱冷凍層取出魚，放入勻漿器，加入2 mL的10 mmol/L HCl勻漿后，移入離心管中，用蒸餾水潤洗勻漿器3次，潤洗液同樣移入離心管，每管定容至9.00 mL，高速冷凍離心機（TGL－16M，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）以6 000 r/min離心10 min。2）離心后將上層液移入250 mL分液漏斗中，用少量蒸餾水潤洗離心管，再加入50 mL蒸餾水稀釋，加入10 mL環己烷，輕微振蕩后傾斜漏斗，下端朝上輕開閥門放氣，重復3次；劇烈振蕩20次，靜置2 h。3）靜置分層后，棄除下層水相，有機相有乳化現象，加入2 mL無水乙醇，振蕩溶解去乳化，繼續靜置分層，棄除下層水相，用長吸管取上層有機相移入10 mL離心管；用氮氣吹至盡干，甲醇定容至2.00 mL，用注射器將樣品過0.45 μm濾膜，移入小試管待測。4）移取50 mL染毒試驗液，加入1mL mol/L HCl酸化，移入250 mL分液漏斗中，加入10 mL環己烷，按步驟3進行萃取。5）用高效液相色譜儀（Lab－600，北京萊伯泰科儀器有限公司）測定有機物濃度。

1.2.3 SOD酶活性測定試驗

在25℃條件下，將每mg組織蛋白每min抑制鄰苯三酚自氧化率達50%定義為1個酶活性單位，U/mg（以蛋白計，全文同）。SOD酶活性公式為：

式中，A為未添加酶源上清液的鄰苯三酚自氧化速率；B為添加酶源上清液的鄰苯三酚自氧化速率；V總為反應總體積，mL；V樣為加入提取上清液的體積，mL；V定義為酶活性力單位定義體積，1 mL；C為提取液的蛋白質濃度，mg/mL。

毒性暴露試驗：根據急性毒性試驗結果，以斑馬魚的96 h LC50為基準，分別選擇其1/5、1/10、1/12、1/15和1/20（表1）作為富集試驗暴露濃度進行毒性暴露試驗。用200 mL容量瓶配制染毒液并轉移至暴露試驗容器（250 mL燒杯），每個濃度組放入2條魚，同時設置空白和助溶劑對照，每24 h更換1次染毒液，期間不喂食，觀察魚的生理情況。恒溫培養箱培養，分別測定暴露1 d和7 d后，斑馬魚體內SOD酶活性。暴露試驗結束后，斑馬魚低溫冷凍殺死，吸干體表水稱重，于冰箱冷凍層保存。

表1 斑馬魚SOD酶活性測定試驗的染毒液濃度Table 1 The concentration of SOD activity determination in zebrafish

酶源上清液制備：將斑馬魚放入勻漿器中，按1∶10（質量/體積比）加入預冷的蔗糖－緩沖溶液（800 mg/L NaCl、400 mg/L EDTA、0.01 mol/L HCl－Tris、8.6×104mg/L蔗糖）冰浴勻漿，用高速冷凍離心機離心10 min（1℃，6 000 r/min）。取上清液用蔗糖－緩沖液稀釋10倍，制成稀釋100倍的提取液，即酶源上清液，于冰箱低溫保存待用。

蛋白質濃度測定：根據考馬斯亮藍法（Bradford），取0.3 mL酶源液，加入0.15 mol/L的NaCl溶液1.7 mL，考馬斯亮藍（G－250）10.0 mL，反應5 min，在595 nm下測定吸光度，依據制定好的蛋白（牛血清白蛋白BSA）標準工作曲線，計算酶源液中蛋白質濃度。

SOD酶活性測定：采用鄰苯三酚法。1）鄰苯三酚自氧化速率測定。在25 mL比色管中加入10 mL Tris－HCl（pH為8.2）緩沖液，再加入9 mmol/L鄰苯三酚0.2 mL，迅速倒入1 cm比色皿中混勻并計時，以Tris－HCl緩沖液為參比，于325 nm測定吸光度，從1 min開始，每30 s讀數1次，連續讀5 min，以吸光度對時間作圖，斜率即為自氧化速率。2）測定SOD酶抑制鄰苯三酚的自氧化速率。在25 mL比色管中加入10 mL Tris－HCl緩沖液、2 mL酶液，混勻后再加入9 mmol/L鄰苯三酚0.2 mL，其余同鄰苯三酚自氧化速率測定。

1.3 統計方法

數據用SPSS19.0軟件進行計算處理，數據結果以均值±標準偏差表示，并以Origin8作圖。

2 結果與分析

2.1 斑馬魚對 4-CP、2，4-DCP和 2，4，6-TCP的KBCF

富集系數是指生物體內某種元素或難分解的化合物的濃度與其所生存的環境中該物質的濃度之比，一般用來表示生物濃縮的程度。氯酚對斑馬魚的KBCF表示為：

式中，C魚為氯酚在斑馬魚中的濃度，mg/g；C水為氯酚在水中的濃度，mg/g。

2.1.1 試驗數據結果

按照1.2.2節的試驗方法，進行7 d染毒液對斑馬魚的毒性暴露試驗，得到各濃度組斑馬魚體內毒物的KBCF（表2）。

表2 斑馬魚對4-CP、2，4-DCP和2，4，6-TCP的KBCFTable 2 The KBCFof 4-CP，2，4-DCP and 2，4，6-TCP to zebrafish

2.1.2 結果分析

由表2可知，經過7 d暴露試驗后，斑馬魚對4-CP、2，4-DCP和2，4，6-TCP的KBCF分別為33.645 ±5.292、65.541±10.492和128.051±39.828。

根據魚體內毒物富集分類［20］，10＜KBCF≤60為無富集；60＜KBCF≤700為輕度富集；700＜KBCF≤8 000為中毒富集；KBCF大于8 000為高度富集。可以看出，在7 d暴露試驗下，斑馬魚對4-CP無富集作用；對2，4-DCP和2，4，6-TCP表現出輕度富集。進一步分析可以得出，斑馬魚對3種氯酚物質的富集作用關系表現為4-CP＜2，4-DCP＜2，4，6-TCP，富集作用的大小與3種物質苯環上的氯原子取代基個數呈正相關，具體表現為隨著酚類苯環上氯原子取代基個數的增多，富集作用增強。

梁丹濤等［21］以斑馬魚為受試物，進行了六六六對斑馬魚的生物富集作用研究，結果顯示，暴露4 d時，KBCF為2.58×104，當暴露延長到6 d時，KBCF增加到3.10×104。與該研究結果相比，斑馬魚對所選擇的易揮發的3種氯酚富集作用小得多。分析原因不難得出，六六六作為PCPs之一，其難降解、高持久等特性使得其在動物體內的富集速度非常快。鄒積鑫等［22］進行了乙羧氟草醚對斑馬魚的急性毒性和生物富集性研究，富集試驗設置2個濃度（0.03和0.30 mg/L），暴露時間持續8 d，測得KBCF分別為1.16和2.43，由于乙羧氟草醚水溶性差，降解快，因此表現為無富集；綜合考慮可以得出，同種受試物（斑馬魚）對不同物質的富集能力不同，其富集能力可相差達到數量級。

2.2 3種氯酚對斑馬魚SOD酶活性的影響

2.2.1 4-CP對斑馬魚酶活性影響

4-CP對斑馬魚酶活性影響如圖1所示。由圖1可知，斑馬魚在4-CP濃度為0.323 8～1.290 5 mg/L的各組暴露1 d，斑馬魚SOD酶活性性均顯著高于空白，說明SOD酶活性均被誘導。整體表現為隨著暴露濃度的增加，酶活性先降低再升高，在4-CP濃度為0.539 6 mg/L處酶活性表現為最大，約為空白的2倍；在4-CP濃度為0.431 7 mg/L處酶活性表現為最小，為空白的124%。隨著暴露時間延長至7 d，在4-CP濃度為0.323 8 mg/L處對斑馬魚的SOD酶活性高于空白，表明此時該濃度下的SOD酶活性被誘導，SOD酶活性為（141.63±13.90）U/mg；在4-CP濃度為0.431 7～1.290 5 mg/L時對斑馬魚的SOD酶活性均低于空白，隨濃度的增加，酶活性表現出先下降后升高再下降的趨勢，SOD酶均被抑制。綜合1 d和7 d的暴露結果可知，在4-CP濃度相同時，4-CP暴露7 d對斑馬魚SOD酶活性均低于暴露1 d對斑馬魚的SOD酶活性。說明隨著暴露時間的延長，4-CP對斑馬魚表現出先誘導后抑制效應。

圖1 4-CP濃度對斑馬魚SOD酶活性影響Fig.1 The effect of 4-CP on SOD activity of zebrafish

2.2.2 2，4-DCP對斑馬魚酶活性影響

2，4-DCP對斑馬魚酶活性影響如圖2所示。由圖2可以看出，斑馬魚在2，4-DCP濃度為0.216 3～0.865 4 mg/L的各組暴露1 d，2，4-DCP對斑馬魚SOD酶活性均大于空白，表現為誘導效應。1 d暴露試驗表現為隨著暴露濃度的增加，斑馬魚SOD酶活性先升高再降低，再升高再降低，2，4-DCP濃度為0.288 5 mg/L時斑馬魚酶活性表現為最大（575.7± 17.6）U/mg，約為空白的4.5倍；在2，4-DCP濃度為0.865 4 mg/L時，酶活性表現為最小（178.6±7.9）U/mg，為空白的138%。當暴露時間延長至7 d時，可看出各濃度組斑馬魚的SOD酶活性均略小于空白，在7 d暴露試驗整體表現為隨著濃度的增加，斑馬魚的SOD酶活性先下降再升高，斑馬魚的SOD酶活性均被抑制。綜合1 d和7 d的暴露結果得出，2，4-DCP暴露7 d對斑馬魚的SOD酶活性均低于暴露1 d對斑馬魚的SOD酶活性，說明隨暴露時間的延長，2，4-DCP對斑馬魚表現出先誘導后抑制效應。

圖2 2，4-DCP濃度對斑馬魚SOD酶活性影響Fig.2 The effect of 2，4-DCP on SOD activity of zebrafish

2.2.3 2，4，6-TCP對斑馬魚酶活性影響

2，4，6-TCP對斑馬魚酶活性影響如圖3所示。由圖3可知，斑馬魚在2，4，6-TCP濃度為0.056 6～0.226 4 mg/L的各組暴露1 d，對斑馬魚的酶活性均大于空白，均表現為誘導效應，1 d暴露分析可得，隨著暴露濃度的增大，斑馬魚的SOD酶活性先升高后下降，并在 0.094 3 mg/L濃度處表現為最大（815.9±27.8）U/mg，約為空白的6倍；在0.226 4 mg/L濃度處表現為最小，約為空白的3倍。隨著暴露時間延長至7 d，在2，4，6-TCP濃度為0.056 6 mg/L時斑馬魚SOD酶活性略大于空白，其余濃度組斑馬魚SOD酶活性均小于空白，7 d暴露表現為隨濃度的增大酶活性逐漸減小，整體表現為抑制效應。綜合1 d和7 d的暴露結果可知，相同濃度下，暴露7 d的2，4，6-TCP對斑馬魚的SOD酶活性均低于暴露1 d斑馬魚的SOD酶活性，說明隨暴露時間的延長，2，4，6-TCP對斑馬魚表現出先誘導后抑制效應。

圖3 2，4，6-TCP濃度對斑馬魚SOD酶活性影響Fig.3 The effect of 2，4，6-TCP on SOD activity of zebrafish

SOD是機體內天然存在的最重要的超氧自由基清除因子，可把有害的超氧自由基轉化為過氧化氫。綜上分析，3種氯酚對斑馬魚SOD酶活性的影響，暴露1 d時，在低濃度的3種氯酚刺激下，使斑馬魚產生更多的SOD來抑制外界刺激，導致SOD酶活性升高，即表現為誘導作用，隨著濃度的增大和時間的延長，外界刺激也增大，導致斑馬魚產生SOD生理功能受到損害，間接導致SOD酶活性降低，即表現為抑制作用。

3 結論

（1）斑馬魚對2，4-DCP、2，4，6-TCP表現出輕度富集性，對4-CP無富集。斑馬魚對3種氯酚的富集順序為4-CP（無富集）＜2，4-DCP（輕度富集）＜2，4，6-TCP（輕度富集）。隨著酚類苯環上氯原子取代基個數的增多，富集作用增強。

（2）綜合3種氯酚對斑馬魚SOD酶活性試驗得出，經過1 d暴露，對SOD酶活性呈先誘導后抑制效應，暴露延長至7 d時SOD酶活性被抑制。

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Study on Bioconcentration of Three Chlorophenols in Zebrafish and SOD Activity Stress Action

SONG Zhi-hui1，2，SUN Xin-xin2，LI Han-dong1
1.State Key Laboratory of Environmental Criteria and Risk Assessment，Chinese Research Academy of Environmental Sciences，Beijing 10012，China
2.College of Environment and Safety Engineering，Qingdao University of Science＆Technology，Qingdao 266042，China

To study the physio-toxicity effect of 4-chlorophenol，2，4-dichlorophenol and 2，4，6-trichlorphenol on zebrafish，the evaluation indicator of 7 d KBCFand SOD activity with different exposure concentrations were determined using zebrafish by semi-static test.The results showed that the 7 d KBCFof 4-CP，2，4-DCP and 2，4，6-TCP to zebrafish were 33.65±5.29，65.54±10.49 and 128.05±39.83，respectively，and the bioconcentration factor followed the order of 4-CP＜2，4-DCP＜2，4，6-TCP.The bioconcentration of the chlorophenols to zebrafish and the numbers of chloro derivatives had positive correlation.The results of stress action test of the chlorophenols to zebrafish showed that the effect at 1 d was induction-inhibition and at 7 d the effect was inhibition，indicating significant variation of SOD activity.

zebrafish；4-chlorophenol；2，4-dichlorophenol；2，4，6-trichlorphenol；SOD

X174

A

10.3969/j.issn.1674-991X.2014.04.047

1674－991X（2014）04－0287－06

2014－01－28

環境保護公益性行業科研專項（201109037）

宋志慧（1972—），男，副教授，博士，主要從事環境生態毒理學、環境生物控制以及清潔生產審核咨詢工作，songhuey＠sina.com

*責任作者：李捍東（1959—），女，研究員，博士，長期從事化學品環境效應及環境微生物研究，li_han_dong＠163.com