柯薩奇病毒A組16型VP1蛋白的原核表達

王志宏+丁瑩瑩+馮嬌嬌+李連青+潘衛+郭存九

[摘要] 目的 構建重組質粒柯薩奇病毒A組16型（coxsackievirus group A type 16，CA16）VP1，并進行原核表達及鑒定。方法 用PCR方法擴增CA16 VP1序列，構建其重組表達質粒pET21b-CA16 VP1，并轉入大腸桿菌E. coli BL21（DE3）進行誘導表達及純化，SDS-PAGE鑒定表達及純化產物，間接ELISA方法檢測重組蛋白CA16 VP1的抗原性和有效性。結果 成功原核表達并純化了CA16 VP1蛋白，可與小鼠抗CA16病毒血清特異性結合，與太原市老年人群中部分血清存在高反應性。 結論 CA16 VP1蛋白獲得成功表達，ELISA檢測具有良好的抗原性和有效性，為CA16診斷試劑盒的研究奠定基礎。

[關鍵詞] 柯薩奇病毒A組16型；VP1蛋白；原核表達；酶聯免疫吸附

[中圖分類號] R373.2；R392-33 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2014）14-0069-04

手足口病（Hand foot and mouth disease，HFMD）是一種全球性的傳染病，自1957年新西蘭首次報道以來[1]，世界各地均有不同程度的流行[2-5]。近年來，手足口病疫情呈不斷上升的趨勢，尤其在亞太地區。2008年，我國將其列為法定丙類傳染病進行監測，目前 HFMD的發病率和死亡率在丙類傳染病中仍居首位。引起HFMD的腸道病毒有20多種，其中柯薩奇病毒A組16型（coxsackievirus group A type 16，CA16）和EV71最為常見[6]，其他腸道病毒像CA4、CA5、CA9、CA10、CB2和CB5也可以引起[7]。CA16 基因組全長7410 bp，其中VP1基因長891 bp，編碼297個氨基酸殘基[8]，CA16 VP1含有許多線性中和表位，VP1基因與腸道病毒血清型完全對應，可作為腸道病毒屬內不同血清分類依據，也可作為小RNA病毒科分類依據[9]。因此，CA16 VP1基因已成為研究CA16的重要對象。本實驗旨在構建pET21b-CA16 VP1重組表達質粒，在大腸桿菌中原核表達并純化CA16 VP1重組蛋白，并檢測其抗原性和有效性，為CA16診斷試劑盒的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒、菌株、細胞、病毒及試劑

原核表達載體pET21b購自Novagen公司，大腸桿菌（E. coli）BL21（DE3）和Top10菌株購自TAKARA公司。CA16病毒和RD細胞由上海市疾病預防控制中心提供。限制性核酸內切酶BamH I、HindIII和DNA Marker（DL2000）購自寶生物工程（大連）有限公司；Taq DNA 聚合酶試劑盒購自天根生化科技有限公司；T4 DNA連接酶（Ligation High kit）購自東洋紡（中國上海）生物科技有限公司；PCR小量膠回收試劑盒購自北京天恩澤科技有限公司。金屬螯合親和層析介質（Ni-NTA）購自德國QIAGEN公司。重組質粒pET32a-CA16 VP1、純化的pET32a蛋白和LD5由第二軍醫大學病原生物學教研室制備并保存，其中LD5為一種新型免疫球蛋白結合分子（NEIBM），可與Ig的VH3和Vk區域雙結合，與IgG有較高的親和力[10-12]。

1.2 實驗動物及血清標本

清潔級BALB/C小鼠，雌性，6周齡，16～18 g，由第二軍醫大學實驗動物中心提供；2013年5月29日～5月30日山西醫科大學第二附屬醫院檢驗科95份太原市老年人血清，其中男48例，女47例，平均年齡（61.0±14.0）歲。

1.3 引物的設計及合成

根據CA16 VP1基因（NCBI 登錄號：AEO12126.1）序列自行設計引物，上游P1：5′-GGCCCGGGGATCCGGGTGACCCGATCGCTGAC-3′（下劃線部分為BamH I酶切位點），下游P2：5′-CGCCCGCGGAAGCTTCAGAGTAGTGATTTTGTC-3′（下劃線部分為Hind III酶切位點），擴增片段大小為891 bp。引物由上海生工生物有限公司合成。

1.4 CA16 VP1基因的擴增

以pET32a-CA16 VP1質粒為模板，P1、P2為上下游引物，PCR擴增CA16 VP1基因， PCR擴增條件為：94℃預變性5 min；4℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s，共35個循環；72℃ 延伸10 min。1.2%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢測。

1.5 重組表達質粒的構建

將試劑盒回收的PCR產物和表達載體pET21b用BamH I和Hind III雙酶切，回收目的基因片段和載體片段，以T4 DNA連接酶16℃連接過夜，連接產物轉化到感受態E.coliTOP10中，過夜培養后挑取單克隆菌落，37℃搖菌16 h后提取質粒，用BamH I和Hind III雙酶切鑒定。鑒定正確的質粒送上海杰李生物技術有限公司測序。

1.6 重組蛋白的表達

將測序正確的重組質粒轉化至E.coli BL21（DE3）中，挑取單克隆菌落，接種于2 mL LB（100 μg/mL Amp+15μg/ mL Kana）培養基中，37℃培養7 h，按1%接種量接種到50 mL LB培養基中，37℃、230 rpm振蕩培養過夜；將50 mL過夜菌液轉接至新鮮的450 mL LB中，37℃、230 rpm振蕩培養至A600為0.6，加IPTG 至終濃度為1 mmol/L，誘導4 h，離心收集細菌沉淀，在冰浴的條件下超聲300次，每次超聲3 s，間隔3 s；離心收集上清和沉淀，進行12% SDS-PAGE分析。

1.7 重組蛋白的純化endprint

取重組菌破菌沉淀，加8 mol/L（pH8.0）尿素10 mL重懸，4℃裂解過夜；離心收集上清用于純化，純化按Qiagen公司Ni-NTA說明書進行。12% SDS-PAGE分析，BandScan軟件分析重組蛋白的純度。

1.8 小鼠抗CA16病毒血清的制備

將RD細胞接種到培養瓶中，當RD細胞長滿80%時，加入CA16病毒懸液，37℃，5%的CO2培養箱中培養4～5 d，收集細胞并反復凍融三次，離心收集病毒懸液并腹腔注射5只BALB/c小鼠，病毒劑量按200 μL/只，共注射3次，每次間隔2周。第3次注射后1周采血，分離血清。

1.9 間接ELISA法檢測重組蛋白的抗原性及有效性

將重組蛋白pET21b-CA16 VP1和pET32a用100 mmol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.6）以1：200稀釋，分別包被于酶標板100 μL/孔，37℃孵育2 h，棄上清；10%的脫脂奶粉37℃封閉2h；每孔加入2倍系列稀釋（1：20～1：5120）的小鼠抗CA16 病毒血清和太原市老年人血清100 μL，37℃孵育45 min，PBST洗液洗4次；加入1∶2000稀釋的辣根過氧化物酶標記的LD5 100 μL，37℃孵育45 min；PBST洗液洗4次，TMB顯色液顯色，于450 nm波長處測定吸光度值（A450）。

1.10統計學方法

實驗數據使用SPSS17.0軟件進行統計學分析，數據符合偏態分布，兩組間比較采用兩獨立樣本的秩和檢驗，P<0.05為差異有統計學意義，采用GraphPad Prism 5軟件進行作圖分析。

2 結果

2.1 CA16 VP1 基因的擴增

以pET32a-CA16 VP1質粒為模板，P1、P2為上下游引物，PCR擴增CA16 VP1基因，CA16 VP1基因經1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見891bp的特異性條帶，大小與理論值相符，見圖1。

2.2 pET21b-CA16 VP1質粒的鑒定

重組質粒pET21b-CA16 VP1經BamH I和Hind III雙酶切，經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見約5400 bp的載體片段和891 bp的目的基因片段，與理論值相符，見圖2。

M：DL2000 Marker ；1：未酶切pET21b-CA16 VP1；

2：pET21b-CA16 VP1雙酶切后產物

2.3 CA16 VP1蛋白的表達

將pET21b-CA16 VP1質粒轉入大腸桿菌E.coli BL21（DE3）中誘導表達，經12% SDS-PAGE檢測，結果可見相對分子質量約34KDa的條帶，大小與理論值相符，重組蛋白pET21b-CA16 VP1主要存在于破菌沉淀中，以包涵體形式表達。經BandScan軟件分析，目的蛋白表達量約占菌體總蛋白的24%，見圖3。

2.4 CA16 VP1蛋白的純化

重組蛋白CA16 VP1經Ni-NTA親和層析純化后，12% SDS-PAGE檢測，結果可見相對分子質量約34KDa的單一蛋白條帶，經BandScan軟件分析，重組蛋白的純度達90%以上。見圖4。

2.5 CA16 VP1的抗原性分析

5只BALB/c小鼠經CA16病毒4次免疫后，用間接ELISA方法檢測純化的重組蛋白CA16 VP1與倍比稀釋的小鼠抗CA16病毒血清的反應性，結果顯示，小鼠抗CA16病毒血清可與純化的重組蛋白特異性結合，A450值隨小鼠抗CA16病毒血清濃度的稀釋逐漸降低，以1∶20～1∶60稀釋度下降尤為明顯，與pET32a蛋白僅有較弱的結合，見圖5。

2.6 CA16 VP1的有效性分析

95份太原市老年人血清與重組蛋白CA16 VP1的間接ELISA檢測，結果顯示：重組蛋白 CA16 VP1與太原市老年人血清反應的A450（中位數0.912，四分位數間距0.638）明顯高于對照組pET32a蛋白與人血清反應的A450（中位數0.486，四分位數間距0.172），差異有統計學意義（P<0.01），見圖6。將重組蛋白 CA16 VP1與太原老年人血清反應的A450值從高到低依次排列顯示，A450值呈線性分布，出現高、中、低三種A450值，而且有7例血清的A450值明顯高于其他人血清的A450值，見圖7。

3 討論

以往研究認為CA16僅引起輕微癥狀[13]，EV71能引起嚴重的并發癥及死亡率[14，15]，因此大多數手足口病的研究主要針對EV71，CA16常被忽視。然而近幾年研究發現，感染CA16的患者也能引起嚴重并發癥[16]，甚至死亡[17]，CA16日益受到人們的重視。

本實驗構建了重組表達質粒pET21b-CA16 VP1，并在大腸桿菌BL21（DE3）中表達了CA16 VP1蛋白，SDS-PAGE分析顯示，表達的重組蛋白CA16 VP1主要以包涵體形式存在，之所以出現包涵體是因為這些蛋白在體內過量表達，以至于沒有足夠的時間正確折疊，二硫鍵不能正確地配對，過多的蛋白間非特異性結合，蛋白質無法達到足夠的溶解度[18]，重組蛋白經Ni柱親和層析純化后純度達90%以上，由于載體蛋白pET21b分子量很小，僅含有27個氨基酸，因此，選擇pET32a載體蛋白作為陰性對照。

為確定重組蛋白CA16 VP1是否具有抗原性，我們用小鼠抗CA16病毒血清來檢測重組蛋白CA16 VP1，結果表明，重組蛋白CA16 VP1與小鼠抗CA16病毒血清的反應明顯高于與pET32a蛋白的反應，表明CA16 VP1蛋白具有良好的抗原性和特異性。本實驗結果還顯示，在每個血清稀釋下，5只小鼠抗CA16病毒血清與重組蛋白CA16 VP1反應的A450值有高有低，而與pET32a蛋白反應的A450值均小于0.5且它們之間的差異很小，表明不同小鼠對相同CA16病毒產生的抗體不同，小鼠之間存在個體差異；小鼠抗CA16病毒血清與pET32a蛋白無結合反應。endprint

為進一步了解重組蛋白CA16 VP1能否有效檢測人群中抗CA16 VP1抗體，我們用表達的重組蛋白CA16 VP1檢測太原市老年人血清，結果表明，重組蛋白CA16 VP1作為抗原能有效檢測人群中抗CA16 VP1抗體，有7例血清與重組蛋白存在高的結合反應，表明表達的重組蛋白能夠成為一種臨床檢測用抗原。由于本次實驗沒有對這7例血清進行中和實驗來確定他們是否感染過CA16病毒，有待我們在后續的實驗中進一步驗證。

綜上所述，本實驗成功構建了重組表達質粒pET21b-CA16 VP1，原核表達并純化了CA16 VP1重組蛋白，能與小鼠抗CA16病毒血清發生特異性反應，能檢測出人血清中抗CA16抗體，說明其具有良好的抗原性和有效性，本實驗為CA16診斷試劑盒的研究奠定基礎。

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（收稿日期：2014-03-13）endprint

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