一種電擊轉化枯草芽孢桿菌方法的優化

張爽，薛正蓮，陳環，蘇燕南，王洲

(安徽工程大學生物與化學工程學院，安徽蕪湖 241000)

一種電擊轉化枯草芽孢桿菌方法的優化

張爽，薛正蓮，陳環，蘇燕南，王洲

(安徽工程大學生物與化學工程學院，安徽蕪湖 241000)

提出了一種電擊轉化枯草芽孢桿菌的方法。該方法通過調節細胞培養和電擊轉化過程中培養基和溶液成分來調節細胞滲透壓，提高細胞在高電場強度電擊后的存活率而達到提高轉化效率的目的。優化前的轉化率為5.0×105cfu/μg，經優化后轉化效率可達8×106cfu/ μg，比優化前提高了15倍。

枯草芽孢桿菌;電擊轉化;轉化率

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是一種重要的工業微生物，其遺傳學和生理學特性已得到深入研究［1］，人們對其遺傳背景和生理特性的了解僅次于E.coli［2］?？莶菅挎邨U菌能直接將目的基因產物分泌到培養基中，且表達產物可溶、可正確折疊，具有生物活性，同時表達產物與胞內蛋白分離，無需破碎細胞，利于分離純化，是極具應用前景的基因表達宿主［2］。

但是，在枯草芽孢桿菌工程菌構建過程中，能自發形成感受態的菌株極少，且感受態持續時間短暫，分子克隆效率低，從而限制了外源蛋白在枯草芽孢桿菌中的高效表達［3］。目前外源基因導入宿主菌的主要手段有感受態法［4］、原生質體轉化法［5］和電擊轉化法［6］。其中，電擊轉化法被認為是轉化效率最高的一種方法。然而，電擊轉化過程中需要平衡轉化效率和死亡率的關系，隨著電場強度的增加，外源DNA進入宿主細胞的可能性越大，死亡率也隨之增加。陸雁等［7］以不同預培養時間優化復制子轉化至枯草芽孢桿菌WB600中，最高轉化率為2.58×104cfu/μg;王培培等［8］對枯草芽孢桿菌NCD電轉化條件進行優化，最高效率為6.07×104cfu/μg;而目前芽孢桿菌電擊轉化的轉化效率最高為1.4×106cfu/μg［9-10］，還不能滿足高效率轉化，如構建基因文庫的要求。本實驗通過對枯草芽孢桿菌制備感受態時生長狀態、穿梭載體加入量、回復培養基、電擊轉化緩沖液以及電擊時電壓的選擇等方面條件的優化，使枯草芽孢桿菌的轉化率增大，為后續實驗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

枯草芽孢桿菌WB600、大腸桿菌JM109、穿梭載體pHY-p43均由江南大學生物工程學院余曉斌教授(實驗室)惠贈;分子生物學試劑及試劑盒均購買于生工生物(上海)股份有限公司，其他試劑均為國產分析純。

1.1.2 培養基

LB液體培養基的制備方法:胰蛋白胨質量濃度為10 g/L，酵母提取物質量濃度為5 g/L，氯化鈉質量濃度為10 g/L，pH值為7.2。

LB固體培養基的制備方法:胰蛋白胨質量濃度為10 g/L，酵母提取物質量濃度為5 g/L，氯化鈉(NaCl)質量濃度為10 g/L，瓊脂粉質量濃度為1.5 g/L，pH值為7.2。

SLB培養基的制備方法:蛋白胨質量濃度為10 g/L，酵母粉質量濃度為5 g/L，NaCl質量濃度為10 g/L，山梨醇的濃度為0.5mol/L，pH值為7.2。

ORM培養基的制備方法:蛋白胨質量濃度為10 g/L，酵母粉質量濃度為5 g/L，NaCl質量濃度為10 g/L，山梨醇的濃度為0.8 mol/L，pH值為7.2。

RM培養基的制備方法:蛋白胨質量濃度為10 g/L，酵母粉質量濃度為5 g/L，NaCl質量濃度為10 g/L，山梨醇的濃度為0.5 mol/L，pH值為7.2。

1.1.3 試劑

氨芐青霉素:儲存濃度為50 mg/mL，工作濃度為50 μg/mL;

四環素:儲存濃度為5 mg/mL，工作濃度為50 μg/mL;

SMG緩沖液:0.5 mol/L山梨醇，0.5 mol/L甘露醇，10 g/L甘油。使用去離子水配制，121℃滅菌20 min;

SG緩沖液:0.5 mol/L山梨醇，10 g/L甘油，使用去離子水配制，121℃滅菌20 min;

MG緩沖液:0.5 mol/L甘露醇，10 g/L甘油，使用去離子水配制，121℃滅菌20 min;

Gly緩沖液:10 g/L甘油，使用去離子水配制，121℃滅菌20 min。

1.2 枯草芽孢桿菌制備

從4℃冰箱中取出保藏的枯草芽孢桿菌WB600，活化菌株;用移液槍吸取1 mL過夜培養物在無菌凈化臺接種于40 mL SLB培養基中，37℃，200 r/min振蕩培養至OD600nm=0.7;將菌液冰水浴10 min后，放入離心管中，4℃，5 000 r/min離心5 min，棄上清，收集細胞;在無菌凈化臺上用0℃預冷的40 mL SMG緩沖液通過移液槍吹懸步收集的細胞，4℃，5 000 r/min離心5 min，棄上清，收集細胞，漂洗4次;用2 mL SMG緩沖液吹懸收集的細胞，分裝于離心管(60 μL/管)中，-80℃保存，每管約有6×108個感受態細胞。

1.3 電擊轉化

取50 ng pHY-P43質粒DNA，加入到1管感受態細胞中，在冰上通過移液槍輕微吐吸使pHY-P43質粒DNA和感受態細胞充分混勻，冰浴2 min;將體系轉移至0℃預冷的電擊杯(1 mm)中，用電轉儀進行電擊(電壓21 kV/cm，電容25 μF，電阻200 Ω，電擊1次，時間常數=5 ms);立即向電擊杯中加入1 mL ORM培養基，通過移液槍反復輕輕吹打混勻;將電擊杯中的菌液全部吸出至離心管中，37℃，200 r/min振蕩培養2小時后，將培養體系涂布于含有氨芐青霉素和四環素的LB固體培養基平板，37℃，過夜培養。然后隨機挑取生長出來的單克隆，提取質粒瓊脂糖凝膠電泳，在5 kb左右可見清晰的質粒條帶，說明驗證轉化成功。計數菌落，計算轉化率，轉化率為每μg質粒DNA產生的轉化子數。

2 結果與討論

2.1 枯草芽孢桿菌轉化子的驗證

根據1.4節的步驟將pHY-p43轉化至WB600中，電擊后涂布在含有終濃度為50 μg/mL氨芐青霉素和50 μg/mL四環素的LB固體培養基平板，37℃，過夜培養。然后隨機挑取生長出來的單克隆，提取質粒瓊脂糖凝膠電泳。電泳結果如圖1所示，在5 kb左右有清晰可見的質粒的條帶，說明轉化成功。在平板上計數轉化子數量，平均轉化率為5.0×105cfu/μg。

圖1 轉化子的PCR驗證電泳結果

2.2 枯草芽孢桿菌細胞生長OD值的優化

為了考察枯草芽孢桿菌不同的生長狀態對感受態的制備和后期轉化的影響，培養細胞OD600值分別為0.3，0.5，0.7，0.9，1.1，1.3和1.5時，收集細胞，根據感受態制備方法，制備不同生長時期的感受態。將穿梭載體pHY-p43 50 ng通過電擊轉化至感受態細胞中，涂布于氨芐青霉素和四環素的LB固體培養基平板，計數轉化菌落，計算轉化率。由圖2可知:當OD600值為0.7時，轉化率達到最高，平均為9.8×105cfu/μg。

圖2 不同生長OD值對轉化率的影響

2.3 穿梭載體加入量的優化

在優化穿梭載體加入量的影響時，選擇了枯草芽孢桿菌生長OD值為0.7時制備感受態。在點擊轉化中分別加入20，40，60，80，100和120 ng的穿梭載體pHY-p43，再進行電擊轉化，計算轉化率。由圖3可知:當穿梭載體的加入量為80 ng以上時，轉化達到平衡為2.3×106cfu/μg，所以最終選擇的載體的加入量為80 ng。

圖3 不同載體加入量對轉化率的影響

2.4 電擊后回復培養基的優化

在OD600值為0.7時收集細胞用于感受態細胞的制備，在電擊轉化步驟時加入80 ng的穿梭載體進行電轉化;電擊完成后向電擊杯中加入1 mL回復培養基，選擇的山梨醇濃度分別為0.2，0.4，0.6，0.8，1和1.2 mol/L，其余實驗條件與優化前相同。實驗結果如圖4所示:當山梨醇濃度為0.8 mol/L時，轉化率達到最大值為3.1×106cfu/μg;當山梨醇的濃度大于0.8 mol/L時，轉化效率快速下降，這可能是因為山梨醇濃度過大影響了細胞的滲透壓。

圖4 山梨醇含量對轉化率的影響

2.5 電擊轉化緩沖液的優化

在OD600值為0.7時收集細胞用于感受態細胞的制備，在電擊轉化步驟時加入80 ng的穿梭載體進行電轉化;電擊完成后向電擊杯中加入1mL回復培養基，回復培養基中山梨醇濃度為0.8 mol/L，選擇不同的電擊轉化緩沖液:SMG、SG、MG、Gly，其余實驗條件與優化前相同，如圖5所示。結果表明:使用SMG緩沖液作為電轉緩沖液時轉化率最高，可達4.5×106cfu/μg。

圖5 不同電擊轉化緩沖液對轉化率的影響

2.6 電擊時電壓的優化

在OD600值為0.7時收集細胞用于感受態細胞的制備，將制備的感受態細胞用SMG緩沖液重懸，在電擊轉化步驟時加入80 ng的穿梭載體進行電轉化;電擊完成后向電擊杯中加入1 mL回復培養基，其中的山梨醇濃度為0.8 mol/L。選擇不同的電壓進行電轉化操作:12 kV/cm、15 kV/cm、18 kV/cm、21 kV/cm、24 kV/cm，其余實驗條件與優化前相同。由圖5可知:在電壓為21 kv/cm時轉化率最高，為8.0×106cfu/μg。

圖6 不同電壓對轉化率的影響

3 結束語

當細胞生長OD600值為0.7、質粒DNA加量為80 ng、回復培養基山梨醇濃度為0.8mol/L、電轉緩沖液為SGM以及電場強度為21 kv/cm時，枯草芽孢桿菌轉化率最高。經實驗可知，其最高轉化率為8.0×106cfu/μg，比報道技術效率高4.71倍。該方法為枯草芽孢桿菌的基因工程育種、遺傳學以及分子生物學研究提供了參考。

［1］李明，雙寶，李海濤，等.枯草芽孢桿菌的研究與應用［J］.東北農業大學學報，2009，40(9):111-113.

［2］Tjalsma H，Antelmann H，Jongbloed J D H，et al.Proteomics of Protein Secretion by Bacillus subtilis:Separating the“secrets”of the Secretome［J］.Microbiology and Molecular Biology Reviews，2004，68(2):207-233.

［3］Gary M D，Linda N L，Donald J L.Improved electroporation and cloning vector syst em for gram-positive bact eria ［J］.Applied and Environmental Microbiology，1991，57 (4):1194-1201.

［4］李瑞芳，薛雯雯，黃亮熊，等.枯草芽孢桿菌感受態細胞的制備及質粒轉化方法研究［J］.生物技術通報，2011(5):227-230.

［5］胡欣榮.利用原生質體融合技術選育高纖維素酶活枯草芽孢桿菌的研究［D］.西安:西北大學，2006.

［6］陳濤，王靖宇，班睿，等.枯草芽孢桿菌感受態研究新進展［J］.生命的化學，2004，24(2):130-134.

［7］陸雁，王青艷，朱綺霞，等.枯草芽孢桿菌高效轉化及其轉化子的驗證方式［J］.廣西科學院學報，2012，28 (2)117-119.

［8］王培培，郭慶港、李社增，等.枯草芽孢桿菌NCD-2菌株的高效電擊轉化［J］.中國生物防治學報，2012，27(3)368-372.

［9］Xue G P，Jennifer S J，Brian P D，et al.High osmolarity improves the electro-transformat ion efficiency of the gram-positive bacteria Bacillus subtilis and lichenif ormis ［J］.Journal of Microbiological Methods，1999，34:183-191.

［10］Kiers J L，Van Laeken A E A，Rombouts FM，et al，In vitro digestibility of Bacillus fermented soya bean［J］.Internatonal Journal of Food Microbiology，2000，60:163 -169.

(責任編輯 何杰玲)

Optimization of a Method about Electro-transformation in Bacillus Subtilis

ZHANG Shuang，XUE Zheng-lian，CHEN Huan，SU Yan-nan，WANG Zhou
(Institute of Biologic＆Chemical Engineering，Anhui Polytechnic University，Wuhu 241000，China)

This article provides a method of electro-transformation in Bacillus Subtilis.This method is to regulate cell osmotic pressure and solution composition by regulating cell culture and shock in the process of transformation medium，for improving the survival rate after cells in high electric field intensity of electric shock and achieving the goal that improve the transformation efficiency.The transformation rate is 5.0×105cfu/μg before optimizing.After optimizing，the transformation efficiency is up to 8×106cfu/μg，being 15 times higher than before optimization.It greatly promotes the conversion efficiency.

Bacillus subtilis;electro-transformation;transformation efficiency

Q785

A

1674-8425(2014)08-0060-04

10.3969/j.issn.1674-8425(z).2014.08.013

2014-04-08

安徽省自然科學基金項目(11040606M81);安徽省高校自然科學基金項目(KJ2009A168)

張爽(1989—)，女，安徽宿州人，碩士研究生，主要從事微生物學研究;通訊作者薛正蓮(1967—)，女，安徽巢湖人，碩士，教授，主要從事酶工程研究。

張爽，薛正蓮，陳環，等.一種電擊轉化枯草芽孢桿菌方法的優化［J］.重慶理工大學學報:自然科學版，2014 (8):60-63.

format:ZHANG Shuang，XUE Zheng-lian，CHEN Huan，et al.Optimization of a Method about Electro-transformation in Bacillus Subtilis［J］.Journal of Chongqing University of Technology:Natural Science，2014(8):60-63.