豬脾轉移因子的制備與生物學特性研究

寧豫昌，喬宏興，馬輝

摘要：試驗采用透析法提取了豬脾轉移因子（TF），并對其理化特性、生物安全性以及其對非特異性和特異性免疫的影響等方面進行了初步研究。結果表明，利用透析法制備的豬脾TF能夠顯著（P<0.05）增強小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力；對于E玫瑰花環的形成數和形成率具有極顯著（P<0.01）的促進作用；將豬脾TF與豬瘟疫苗同時使用，能夠顯著（P<0.05）提高機體體液免疫的抗體滴度。此外，制備的豬脾TF安全無毒、無抗原性，不會使異種動物體內產生相應抗體。表明豬脾TF對于機體的特異性和非特異性免疫均有促進作用，是一種安全的生物免疫調節劑。

關鍵詞：豬脾轉移因子（TF）；理化特性；生物安全性

中圖分類號：S852.4；S859.79+7 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）07-1612-04

Preparation of Transfer Factor of Porcine Spleen and Its Biological Characteristics

NING Yu-chang，QIAO Hong-xing，MA Hui

（Henan University of Animal Husbandry and Economy， Zhengzhou 450011， China）

Abstract：The transfer factors（TFs） of porcine spleen were extracted by dialysis method and studied on the physical and chemical properties， biological security， and its effects on non-specific and specific immune. The results showed that TFs significantly enhanced the mouses peritoneal macrophage phagocytosis （P<0.05），and extremely increased the E rosette formation number and rate（P<0.01）. Used with classical swine fever vaccine， the antibody titer of humoral immunity prominently increased（P<0.05）. In addition，the extracted TFs was safe and non-antigenic. The disparate animals had no antibodies produced. It is indicated that TFs of porcine spleen could promote the body's non-specific and specific immune， and was a safe biological immunomodulators. With the further research of TFs，the application of it in controlling animal disease will be more extensive.

Key words： transfer factor（TF）； physical and chemical property； biological safety

轉移因子（Transfer factor，TF）自1949年被發現以來[1]，已被人們廣泛研究。TF是存在于人和動物白細胞中的可透析小分子物質，能將供體所具有的細胞免疫功能轉移給受體，從而非特異性地增強受體的免疫功能[2]。此外，TF還可以通過T細胞來調節B細胞，縮短機體的免疫應答期，產生較高滴度的抗體[3-5]。TF的成分主要包括低聚核苷酸和多肽，相對分子質量約為3 500～5 000，安全無毒，無抗原性，且無種屬差異，是一種新型而又安全的免疫制劑[6]。國內外已將TF用于人醫臨床治療，并取得一定的效果。目前也有將TF用于臨床獸醫的研究和應用方面的報道，如將TF用于雞、豬、牛等動物疫病控制及免疫調節方面[7-9]。總之，TF在獸醫領域具有重要的應用價值和廣闊前景。河南是全國養豬大省，每年伴隨生豬屠宰產生了數量極大的廢棄物，為了變廢為寶，將屠宰廢棄物轉變為價值較高的生物制品，減少生豬屠宰所造成的環境污染，本試驗對豬脾TF的制備方法、理化性質、生物學特性以及其對非特異性和特異性免疫的影響等方面進行了研究，以期為TF能夠普遍應用于獸醫臨床提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

豬脾臟：取新鮮、外觀紅潤、有光澤的豬脾臟（鄭州肉聯廠提供），去除表面脂肪和筋膜；試劑：1%雞紅細胞懸液、綿羊肝素抗凝血（綿羊頸靜脈采血后以10 IU/mL的比例加入肝素鈉）、小牛血清、20%磺基水楊酸、Folin-酚試劑、標準D-核糖、三氯醋酸、二羥基甲苯、無水三氯化鐵、鹽酸、可溶性淀粉、2%茚三酮溶液、Hanks液（無鈣、鎂離子，pH7.2）、豬瘟細胞苗等由鄭州牧業工程高等專科學校生物技術實驗室提供；豬瘟正向間接血凝（IHA）抗體檢測試驗盒購自中國科學院蘭州獸醫研究所。試驗動物：清潔級小白鼠、家兔購自鄭州大學實驗動物中心，試驗豬由鄭州天一高科生物技術有限公司新鄭豬場提供。

1.2 豬脾TF制備工藝

透析法：取新鮮豬脾臟，去除表面脂肪和筋膜，用0.3%苯酚生理鹽水浸洗后，用滅菌生理鹽水清洗3次，剪碎后稱重。加等量滅菌生理鹽水，用高速組織搗碎機高速勻漿2次，每次1 min，置-20 ℃反復凍融3次，5 000 r/min離心30 min，取上清液置于透析袋中，用等量去離子水于4 ℃透析24 h，收集透析袋外液，并用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌即得豬脾TF。-20 ℃保存備用。

1.3 豬脾TF理化特性檢測

觀察提取的豬脾TF的顏色、氣味及表觀性狀，并測定樣品pH；蛋白質反應采用磺基水楊酸法，取適量樣品加入等量20%磺基水楊酸，觀察有無白色混濁物出現；鑒別反應采用茚三酮顯色法，取2 mL樣品加入適量2%茚三酮溶液數滴，加熱后觀察有無顏色變化；采用Folin-酚法檢測樣品中多肽含量；參照《中國生物制品規程》檢測樣品中核糖含量[10]；采用紫外分光光度計測定樣品中核苷酸與多肽的比值，判斷標準為樣品在（251±1） nm處有最大吸收度，且OD260 nm/OD280 nm≥2.0。

1.4 豬脾TF的生物學特性檢測

1.4.1 毒性試驗 取40只小白鼠，平均分成4組，第1組為對照組，每只小鼠腹腔注射0.20 mL滅菌生理鹽水；第2、3、4組為試驗組，分別腹腔注射0.10、0.15、0.20 mL的豬脾TF，連續觀察7 d，且48 h內不得有死亡。

1.4.2 熱原檢驗 取家兔9只，平均分為3組，每只測量正常體溫后15 min內自耳緣靜脈緩緩注入預熱至38 ℃的豬脾TF，劑量為按家兔每千克體重注射2 mL，每隔30 min測量體溫1次，連測3次。

1.4.3 抗原性檢驗 將制備的豬脾TF與等量不完全弗氏佐劑混合，經乳化后制成油包水的乳劑，穩定性檢測合格后，皮下多點注射6只家兔（1 mL/只），每隔1周注射1次，連續注射4次，第4次注射1周后采血，分離血清，通過雙向瓊脂擴散法檢測家兔體內是否產生相應抗體。

1.4.4 小鼠巨噬細胞吞噬功能試驗 取體重18～22 g的小白鼠30只，隨機分為試驗組和對照組，每組15只。每只小鼠腹腔注射0.5%淀粉生理鹽水溶液（取0.5 g可溶性淀粉加入適量蒸餾水中并微沸2 min，冷卻后加入0.9 g NaCl并定容至100 mL）0.5 mL，每天1次，連續注射3次，以誘導試驗組和對照組小鼠腹腔產生巨噬細胞。之后試驗組每只小鼠腹腔注射自制豬脾TF 2 mL，對照組注射等量生理鹽水；12 h后，每只小鼠腹腔注射1%雞紅細胞懸液1 mL。間隔1 h后，頸椎脫臼處死小鼠，正中剪開腹壁皮膚，經腹膜注入生理鹽水1 mL，輕輕按揉鼠腹部1 min，吸出腹腔洗液 0.5 mL，滴于潔凈載玻片上，放入墊有濕紗布的搪瓷盒內，置37 ℃溫育30 min。用生理鹽水漂洗，除去未粘片細胞，晾干。油鏡下計數100個巨噬細胞，并按下列公式計算巨噬細胞的吞噬率和吞噬指數。采用t檢驗處理吞噬率和吞噬指數。

吞噬率=吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數/100×100%

吞噬指數=100個巨噬細胞中吞噬的雞紅細胞總數/100

1.4.5 E玫瑰花環試驗 取小鼠肝素抗凝血（小鼠摘眼球采血后以10 IU/mL的比例加入肝素鈉）2 mL，置37 ℃水浴自然沉淀30～40 min，吸取全部血漿（約1 mL），于血漿中加入適量Hanks液，洗滌，1 500 r/min離心5～10 min，棄上清液，重復洗滌4次，沉淀均勻即為淋巴細胞懸液。取適量的綿羊肝素抗凝血，加數倍Hanks液洗滌3次，最后以Hanks液配成10%綿羊紅細胞懸液，4 ℃保存。取0.1 mL淋巴細胞懸液，加10%綿羊紅細胞懸液0.1 mL，加入豬脾TF 0.1 mL作為試驗組，對照組中不加豬脾TF，其余與試驗組相同。將試驗組和對照組均置于37 ℃水浴10 min，然后低速離心（600 r/min）5 min，吸棄多余上清液后，置4 ℃冰箱2～4 h。取出后，將沉淀輕輕搖起，加0.8%戊二醛0.1 mL，混勻后4 ℃固定15 min。將干凈玻片用Hanks液沾濕，滴一小滴混懸液，讓其自然散開即可。自然干燥后，用姬姆薩-瑞氏液染色，水洗，干燥鏡檢。在顯微鏡下分別計數試驗組與對照組E玫瑰花環形成數（凡淋巴細胞周圍結合3個或3個以上綿羊紅細胞者即為陽性），共檢查200個淋巴細胞，并按下列公式計算E玫瑰花環形成率。所有數據均采用t檢驗處理。

E玫瑰花環形成率=形成花環的淋巴細胞數/淋巴細胞總數×100%

1.4.6 豬脾TF對體液免疫效果的影響 將40頭25日齡仔豬平均分為對照組與試驗組，于免疫前1 d對每頭仔豬采血，以正向間接血凝試驗法測定每頭豬的豬瘟抗體滴度及各組的平均抗體水平。每頭仔豬注射豬瘟疫苗1頭份，其中試驗組每頭仔豬于免疫同時加注1 mL自制豬脾TF。免疫后21 d再次采血，檢測每頭豬的豬瘟抗體滴度及各組的平均抗體水平。采用SPSS軟件對數據進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 理化特性檢測結果

所制備的豬脾TF為淡黃色的透明狀液體，并有淡淡的腥味，其pH 6.3；蛋白質反應未出現混濁或沉淀，說明豬脾TF中不含大分子蛋白質；在豬脾TF中加入適量茚三酮溶液并加熱后，呈現紫色；利用Folin-酚法以及參照《中國生物制品規程》，分別測得豬脾TF中多肽含量為3.15 mg/mL，核糖含量為13.22 μg/mL；將制備的豬脾TF稀釋15倍后，利用紫外分光光度計測得OD260 nm/OD280 nm=2.09，符合要求。

2.2 生物學特性檢測結果

2.2.1 毒性試驗 利用不同劑量豬脾TF對小白鼠進行注射處理，7 d后，試驗組及對照組小白鼠精神、采食等均表現正常，無一例死亡，經剖檢后觀察心臟、肝臟、肺臟、腎臟等臟器均無明顯異常病變（表1）。證明制備的豬脾TF安全、無毒，可以在臨床上使用。

2.2.2 熱原檢驗 由表2可知，所有家兔在注射豬脾TF后的1.5 h內體溫變化均未超過0.6 ℃，即熱原檢驗結果呈陰性。

2.2.3 抗原性檢驗 經雙向瓊脂擴散法檢驗，所制備的豬脾TF未能使家兔體內產生相應抗體，說明豬脾TF不具有抗原性。

2.2.4 小鼠巨噬細胞吞噬功能試驗 通過鏡檢可發現，對照組中發生吞噬作用的巨噬細胞明顯較試驗組中的少（圖1）。經過統計、計算，試驗組小鼠腹腔巨噬細胞吞噬率和吞噬指數與對照組相比均有明顯提高，且差異顯著（P<0.05）（表3）。

2.2.5 E玫瑰花環試驗 經統計學處理可知，加入豬脾TF的試驗組中E玫瑰花環形成數和E玫瑰花環形成率較對照組均有明顯提高，差異極顯著（P<0.01）（表4）。

2.2.6 豬脾TF對體液免疫效果的影響 由表5可見，免疫前試驗組與對照組的豬瘟抗體平均滴度（用以2為底的對數值表示，下同）均為4.45；免疫后21 d，對照組的抗體平均滴度測量值達到5.05，而試驗組的抗體平均滴度測量值則達到6.35，免疫后分別上升了0.60和1.90，經顯著性檢驗，兩者差異顯著（P<0.05）。

3 小結與討論

將新鮮健康豬脾組織經高速組織搗碎機高速勻漿多次，再經反復凍融、離心、透析、過濾除菌，可制得豬脾TF，此法簡便、成本低廉、不需要特殊的器材和設備。此外，由于TF在常溫下易失活，因此，相關操作（如離心、透析）應在低溫下進行。利用透析法制備的豬脾TF無毒性、無熱原、無抗原性，符合獸醫的臨床用藥標準。但是在實際生產中，豬脾臟的來源廣泛，很難確保脾臟組織中不含細菌、病毒等微生物，而采用過濾法并不能保證將各類微生物尤其是病毒完全去除，并且過濾法會延長操作時間，不利于實際生產。因此，應進一步探索采取更加簡便、有效的方法去除組織中的各類微生物。經試驗證明，此次制備的豬脾TF能夠顯著增強小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力，增加E玫瑰花環形成數。說明TF能夠增強動物的非特異性免疫能力，并能夠增強T淋巴細胞的免疫活性。畜禽在接種疫苗后5～7 d才能產生有效的抗體，在這段時間內機體的抗體水平低，抗病能力差，一旦有病原體感染則很容易發病，如果在這段免疫間隙期內使用TF則能有效增強動物的抗病能力。此外，初生動物的免疫功能尚未健全，如果在初生動物中使用成年動物的TF，則能夠增強初生動物的抗病能力，如崔恒宓等[11]通過試驗證明，初生仔豬注射成年豬TF可將成年豬的免疫功能盡早轉移給仔豬，從而促進仔豬的免疫功能發育。有報道指出，TF能夠增強B淋巴細胞的活性，從而增加機體的體液免疫抗體滴度[12]。本試驗結果也表明，在進行豬瘟免疫時配合使用TF，可改善豬的免疫機能，顯著提高其抗體滴度，從而有效提高豬瘟疫苗的免疫效果，值得在生豬免疫中推廣使用。但是本試驗中豬脾TF以1 mL/只的劑量進行使用是否最佳，以及母源抗體水平高低對豬脾TF作用效果有無影響尚需進一步研究證實。通過檢測小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力和E玫瑰花環形成試驗，雖能在一定程度上測定豬脾TF的免疫活性，但是這些試驗結果的判定都存在一定的主觀性，且試驗重復性受到不同批次試驗動物免疫狀態差別的影響，因此，建立適宜的動物模型和簡便有效的活性測定方法，將是今后研究的重點。

參考文獻：

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[9] 郭寶福，郭 鑫，高 爽.TF對奶牛隱性乳房炎的療效觀察[J].中國獸醫雜志，1993（5）：21-22.

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[11] 崔恒宓，金韶華，毛九德，等.豬脾轉移因子的部分生化和免疫性及其應用[J].畜牧獸醫學報，1994，25（4）：317-322.

[12] 喬彥良.動物轉移因子研究與在畜禽疫病防治中的應用[J].中國禽業導刊，2002，19（23）：45-47.

2.2.5 E玫瑰花環試驗 經統計學處理可知，加入豬脾TF的試驗組中E玫瑰花環形成數和E玫瑰花環形成率較對照組均有明顯提高，差異極顯著（P<0.01）（表4）。

2.2.6 豬脾TF對體液免疫效果的影響 由表5可見，免疫前試驗組與對照組的豬瘟抗體平均滴度（用以2為底的對數值表示，下同）均為4.45；免疫后21 d，對照組的抗體平均滴度測量值達到5.05，而試驗組的抗體平均滴度測量值則達到6.35，免疫后分別上升了0.60和1.90，經顯著性檢驗，兩者差異顯著（P<0.05）。

3 小結與討論

將新鮮健康豬脾組織經高速組織搗碎機高速勻漿多次，再經反復凍融、離心、透析、過濾除菌，可制得豬脾TF，此法簡便、成本低廉、不需要特殊的器材和設備。此外，由于TF在常溫下易失活，因此，相關操作（如離心、透析）應在低溫下進行。利用透析法制備的豬脾TF無毒性、無熱原、無抗原性，符合獸醫的臨床用藥標準。但是在實際生產中，豬脾臟的來源廣泛，很難確保脾臟組織中不含細菌、病毒等微生物，而采用過濾法并不能保證將各類微生物尤其是病毒完全去除，并且過濾法會延長操作時間，不利于實際生產。因此，應進一步探索采取更加簡便、有效的方法去除組織中的各類微生物。經試驗證明，此次制備的豬脾TF能夠顯著增強小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力，增加E玫瑰花環形成數。說明TF能夠增強動物的非特異性免疫能力，并能夠增強T淋巴細胞的免疫活性。畜禽在接種疫苗后5～7 d才能產生有效的抗體，在這段時間內機體的抗體水平低，抗病能力差，一旦有病原體感染則很容易發病，如果在這段免疫間隙期內使用TF則能有效增強動物的抗病能力。此外，初生動物的免疫功能尚未健全，如果在初生動物中使用成年動物的TF，則能夠增強初生動物的抗病能力，如崔恒宓等[11]通過試驗證明，初生仔豬注射成年豬TF可將成年豬的免疫功能盡早轉移給仔豬，從而促進仔豬的免疫功能發育。有報道指出，TF能夠增強B淋巴細胞的活性，從而增加機體的體液免疫抗體滴度[12]。本試驗結果也表明，在進行豬瘟免疫時配合使用TF，可改善豬的免疫機能，顯著提高其抗體滴度，從而有效提高豬瘟疫苗的免疫效果，值得在生豬免疫中推廣使用。但是本試驗中豬脾TF以1 mL/只的劑量進行使用是否最佳，以及母源抗體水平高低對豬脾TF作用效果有無影響尚需進一步研究證實。通過檢測小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力和E玫瑰花環形成試驗，雖能在一定程度上測定豬脾TF的免疫活性，但是這些試驗結果的判定都存在一定的主觀性，且試驗重復性受到不同批次試驗動物免疫狀態差別的影響，因此，建立適宜的動物模型和簡便有效的活性測定方法，將是今后研究的重點。

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[12] 喬彥良.動物轉移因子研究與在畜禽疫病防治中的應用[J].中國禽業導刊，2002，19（23）：45-47.

2.2.5 E玫瑰花環試驗 經統計學處理可知，加入豬脾TF的試驗組中E玫瑰花環形成數和E玫瑰花環形成率較對照組均有明顯提高，差異極顯著（P<0.01）（表4）。

2.2.6 豬脾TF對體液免疫效果的影響 由表5可見，免疫前試驗組與對照組的豬瘟抗體平均滴度（用以2為底的對數值表示，下同）均為4.45；免疫后21 d，對照組的抗體平均滴度測量值達到5.05，而試驗組的抗體平均滴度測量值則達到6.35，免疫后分別上升了0.60和1.90，經顯著性檢驗，兩者差異顯著（P<0.05）。

3 小結與討論

將新鮮健康豬脾組織經高速組織搗碎機高速勻漿多次，再經反復凍融、離心、透析、過濾除菌，可制得豬脾TF，此法簡便、成本低廉、不需要特殊的器材和設備。此外，由于TF在常溫下易失活，因此，相關操作（如離心、透析）應在低溫下進行。利用透析法制備的豬脾TF無毒性、無熱原、無抗原性，符合獸醫的臨床用藥標準。但是在實際生產中，豬脾臟的來源廣泛，很難確保脾臟組織中不含細菌、病毒等微生物，而采用過濾法并不能保證將各類微生物尤其是病毒完全去除，并且過濾法會延長操作時間，不利于實際生產。因此，應進一步探索采取更加簡便、有效的方法去除組織中的各類微生物。經試驗證明，此次制備的豬脾TF能夠顯著增強小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力，增加E玫瑰花環形成數。說明TF能夠增強動物的非特異性免疫能力，并能夠增強T淋巴細胞的免疫活性。畜禽在接種疫苗后5～7 d才能產生有效的抗體，在這段時間內機體的抗體水平低，抗病能力差，一旦有病原體感染則很容易發病，如果在這段免疫間隙期內使用TF則能有效增強動物的抗病能力。此外，初生動物的免疫功能尚未健全，如果在初生動物中使用成年動物的TF，則能夠增強初生動物的抗病能力，如崔恒宓等[11]通過試驗證明，初生仔豬注射成年豬TF可將成年豬的免疫功能盡早轉移給仔豬，從而促進仔豬的免疫功能發育。有報道指出，TF能夠增強B淋巴細胞的活性，從而增加機體的體液免疫抗體滴度[12]。本試驗結果也表明，在進行豬瘟免疫時配合使用TF，可改善豬的免疫機能，顯著提高其抗體滴度，從而有效提高豬瘟疫苗的免疫效果，值得在生豬免疫中推廣使用。但是本試驗中豬脾TF以1 mL/只的劑量進行使用是否最佳，以及母源抗體水平高低對豬脾TF作用效果有無影響尚需進一步研究證實。通過檢測小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力和E玫瑰花環形成試驗，雖能在一定程度上測定豬脾TF的免疫活性，但是這些試驗結果的判定都存在一定的主觀性，且試驗重復性受到不同批次試驗動物免疫狀態差別的影響，因此，建立適宜的動物模型和簡便有效的活性測定方法，將是今后研究的重點。

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