腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子Val66Met多態(tài)性與腦出血的關(guān)聯(lián)分析

李繼峰　王娜

[摘要] 目的 探討腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子Val66Met多態(tài)性與腦出血的關(guān)系。 方法 采用限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性技術(shù)檢測腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子Val66Met多態(tài)性，在110例腦出血患者和101名健康對照組中的分布；比較病例組、對照組基因型、等位基因分布差異。 結(jié)果 （1）腦出血組和對照組A基因型分布頻率分別為0.40和0.20，顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（x2=13.81，P=0.001）； （2）兩組等位基因分布頻率差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（x2 =13.12，P=0.000）。 結(jié)論 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子Val66Met多態(tài)性的A等位基因同腦出血相關(guān)，可能該病的易感基因。

[關(guān)鍵詞] 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；Val66Met；多態(tài)性；腦出血

[中圖分類號] R741 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2014）04-62-03

Positive association of brain-derived neurotrophic factor（BDNF） gene Val66Met polymorphism with cerebral hemorrhage

LI Jifeng1 WANG Na2

1.Department of Neurology，Dengfeng People's Hospital， Dengfeng 452470，China；2.Department of Psychiatry，Zhengzhou Ninth People's Hospital，Zhengzhou 450053，China

[Abstract] Objective To explore the possible association between Val66Met polymorphism of BDNF and cerebral hemorrhage in Chinese Han population. Methods We analyzed polymorphisms of the BDNF Val66Met polymorphism with a lfragmentation length polymorphism（RFLP）-based method in 110 patients with cerebral hemorrhage and 101 unrelated healthy control subjects. Results （1）The AA genotypes frequencies of Val66Met polymorphism in cerebral hemorrhage patients and control subjects were 0.40 and 0.20，respectively，the difference was statistic（x2=13.81，P=0.001） （2）The allele frequencies of Val66Met polymorphism in cerebral hemorrhage and control group were significant（x2=13.12，P=0.000）.And the allele A frequency of Val66Met in cerebral hemorrhage patients was significantly higher than that of control subjects （P<0.01）. Conclusion This study suggests that the BDNF Val66Met may be the major risk factors in increasing susceptibility to cerebral hemorrhage in Chinese Han population.

[Key words] Brain-derived neurotrophic factor（BDNF） gene；Val66Met；Polymorphism；Cerebral hemorrhage

既往的研究表明，腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）后，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的表達顯著增高，但是其機制尚不完全明了[1-2]。在BDNF基因眾多的單核苷酸多態(tài)性位點中，位于第五外顯子區(qū)域的Val66Met多態(tài)性同調(diào)節(jié)BDNF的表達密切相關(guān)，但該基因是否同腦出血相關(guān)，目前的報告較少，因此本研究擬采用病例-對照法探討腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因Val66Met的多態(tài)性同腦出血的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

腦出血組：來源于2010年2月～2013年5月期間符合急性ICH入選標準的無腦出血家族史患者110例，其中男62例，女48例，48～76歲，平均（53.4±12.1）歲，全部病例經(jīng)臨床和頭部CT或MRI證實，均符合全國第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會議修訂的診斷標準，無腦出血家族史。

對照組：為同期來醫(yī)院門診體檢的健康人群101例，其中男58例，女43例，47～65歲，平均（51.4±13.2）歲，無腦出血家族史。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 所有研究對象在完成臨床資料采集后，于清晨空腹抽取肘前靜脈血5mL，EDTA抗凝，DNA提取試劑盒為TIANGEN公司的AxyPrep-96全血基因組DNA試劑盒，按照說明書進行DNA抽取，提取的DNA凍存于-70℃冰箱待測。

1.2.2 Val66Met多態(tài)性的檢測 限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性技術(shù)檢測BDNF Val66Met 的多態(tài)性，正向引物序列為：5，-TTTCTCCCTACAGTTCCACCAG-3，反向引物序列為：5，-CTCCAAAGGCACTTGACTACTG-3。PCR的反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1min，95℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)，2%瓊脂糖凝膠電泳分型。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計分析采用SPSS13.0 for windows軟件包進行數(shù)據(jù)處理。采用x2檢驗，分別比較病例組，對照組基因型、等位基因分布差異，并與腦出血患者進行關(guān)聯(lián)分析。使用Hardy-Weinderg Diagnostics Version 2.0軟件分析基因型、等位基因頻率是否符合Hardy-Weinderg平衡定律；顯著性水平為P=0.05。

2 結(jié)果

2.1 BDNF基因Val66Met的多態(tài)性基因型判斷

PmII酶切后等位基因的片段：當(dāng)序列為A（Met）等位基因時，其長度為300bp，當(dāng)序列為G（Val）等位基因時，其長度為180bp和120bp，通過瓊脂糖凝膠電泳來確定個體的基因型。

2.2 SNPs位點的檢測結(jié)果及Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗

采用Hardy-Weinberg遺傳平衡（H-W平衡）檢驗，對Val66Met的SNPs基因型和等位基因進行檢驗，發(fā)現(xiàn)其符合H-W平衡定律（P>0.05）。

2.3 Val66Met位點基因型頻率和等位基因在組間分布頻率的比較

病例組和對照組的Val66Met位點的基因型和等位基因頻度見表1，比較發(fā)現(xiàn)其基因型分布頻率和等位基因頻率組間存在明顯差異（P<0.05）。

3 討論

本研究結(jié)果顯示河南鄭州地區(qū)漢族人群中腦出血患者組和對照組BDNF基因Val66Met多態(tài)AA基因型頻率分別為0.40和0.20，差異具有顯著性（x2=13.81，P=0.001），且腦出血患者組A等位基因頻率顯著高于對照組，差異具有顯著性（x2=13.12，P=0.000），推測Val66Met多態(tài)A等位基因可能是腦出血患者的易感基因。

BDNF基崗位于人染色體11p13上，包含11個外顯子，全長70kb，其中Val66Met位于BDNF基因第11外顯子編碼區(qū)，該位點的核苷酸改變使得BDNF前體蛋向第66號氨基酸由纈氨酸改變?yōu)榈鞍彼幔且诲e義突變，該錯義突變可能影響B(tài)DNF的蛋白結(jié)構(gòu)和功能，進而可能是腦出血患者的易感基因[3-4]。既往的研究表明，A等位基因可能影響到BDNF基因相關(guān)的信號傳導(dǎo)通路，影響B(tài)DNF的功能，進而可能是腦出血的危險因素[5-7]。腦出血后，除誘導(dǎo)損傷區(qū)域的細胞分泌多種致神經(jīng)元損傷的細胞因子外，也激活了神經(jīng)元的自我保護機制。國內(nèi)外的研究已經(jīng)表明，在腦出血患者，BDNF可為損傷神經(jīng)元提供營養(yǎng)而促進其存活與修復(fù)，其血液和腦脊液中BDNF的含量明顯增加，從而達到保護腦出血患者的神經(jīng)元，促進神經(jīng)元再生和功能修復(fù)的作用[8-10]。

因此，我們推測BDNF基因Val66Met多態(tài)性改變了BDNF基因相關(guān)的信號傳導(dǎo)通路，影響了腦出血后BDNF的分泌，而BDNF通過促進血腫周圍神經(jīng)元以自分泌和旁分泌方式作用于自身或鄰近神經(jīng)元，以保護受損神經(jīng)元免遭變性壞死，從而最大限度的保護受損神經(jīng)元。因此本研究提示，在今后的研究中，通過藥物和其他措施提高BDNF的表達水平，延長其表達時間，對于保護受損神經(jīng)元，顯得尤為必要。

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（收稿日期：2013-12-17）