固相萃取與毛細管電泳在線聯用接口的設計與評價

李金祥，孫 巖，王雅琳

(遼寧師范大學化學化工學院，遼寧大連 116029)

固相萃取與毛細管電泳在線聯用接口的設計與評價

李金祥，孫 巖，王雅琳

(遼寧師范大學化學化工學院，遼寧大連 116029)

研究報道一種用于固相萃取與毛細管電泳在線聯用的新接口。該接口采用流動閥原理和鞘流式設計，操作條件優化后, 對接口的性能進行了評價。 利用該接口, 進樣效率高達98%, 表明該接口內不存在樣品稀釋效應; 4 h內100次連續進樣的峰高、峰面積及遷移時間的RSD平均值分別為2.4 %、5.4 %、3.1 %, 表明該接口具有很好的穩定性和重現性。

固相萃取；毛細管電泳；接口

毛細管電泳分析法(capillary electrophoresis, CE)因具有柱效高、速度快、樣品和試劑消耗少和分離模式多等諸多優點而獲得廣泛關注。 該方法通常利用光學原理進行柱上檢測。 然而, 由于進樣體積和毛細管內徑的制約, 毛細管電泳光檢測分析法的濃度靈敏度較低, 致使該方法的應用范圍受到了嚴重限制[1]。解決該問題最有效的方法之一是, 在進行電泳分離之前, 利用固相萃取(solid-phase extraction, SPE)技術對樣品進行預濃縮[2-5]。 為了實現SPE與CE的高效在線聯用, 需要一個特殊設計的接口。 迄今為止, 已經報道了多種聯用接口[6-12], 這些接口可以實現SPE和CE的聯用, 并在不同程度上獲得了成功, 但仍存在許多問題。最主要的問題是接口的死體積過大, 導致了嚴重的樣品擴散和稀釋效應, 致使萃取效率降低。

本研究設計了一種新的鞘流式流動閥接口, 使死體積被減小至納升級, 降低了樣品的稀釋效應, 從而提高了進樣效率。同時接口具有制作簡單、容易實現自動控制等優點。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

紫外-可見光檢測器(Model 500, Lab Alliance, 美國); 恒流注射器泵(LSP01-1 A, 保定蘭格); 高壓直流電源(±30 kV, 北京英達科技); 顯微鏡(XSP-02-640x, 江西鳳凰); 數碼攝像頭(深圳奧尼); 繼電器開關板(深圳龍崗); 雙通道色譜工作站(N-3000, 浙江大學); 微型精密酸度計(B-212, 日本); 超聲波清洗儀(SK2200H, 上海科導); 石英毛細管(河北永年)。

1-氨基-8-萘酚-3,6-二磺酸鈉鹽(H酸, C10H9NO7S2); 8-羥基喹啉-5-磺酸(C9H7NO4S); Na3PO4、NaOH (天津市天河化學試劑廠); 實驗用水均為二次蒸餾水; 所有無機試劑均為分析純。

1.2 SPE-CE系統裝置

聯用系統裝置如圖1所示。SPE柱被一段內徑為25 μm, 長度為10 cm的毛細管空柱所取代, 用一個恒流泵(上) 以一定速度驅動樣品流經該毛細管到達接口內, 模仿SPE洗脫過程, 進而簡化了 SPE系統。顯微鏡與數碼攝像頭相連, 聚焦于接口的中心部位直接觀察和錄像。兩個直流高壓電源分別預設在一個較低和一個較高的電壓下, 用來電動進樣和電泳分離。電泳毛細管內徑50 μm, 外徑375μm, 總長30 cm, 有效長度13 cm。用 UV 檢測器進行柱上檢測，恒流泵(下)驅動緩沖電解質溶液流過接口控制CE進樣，兩個電源和緩沖液泵由繼電器開關板自動控制。石英毛細管在使用前, 依次用0.1 mol·L-1NaOH 溶液、水和Na3PO4緩沖溶液各沖洗5 min。

圖1 SPE-CE系統裝置示意圖

1.3 接口裝置

鞘流式流動閥接口裝置如圖2所示。樣品毛細管出口與電泳毛細管入口之間存有一定縫隙, 二者同軸放置在同一水平通道中。緩沖液從毛細管外壁與連接管內壁之間所形成的環形通道流過, 一部分流入 CE 系統中, 使樣品在高壓電場下分離, 其余部分則攜帶 SPE 柱流出物成廢液流出。CE 分離結束后, 分離電壓回零。此時, 緩沖液停止流動, 樣品流出液則直接收集在兩個毛細管縫隙之間, 在進樣電壓下實現進樣。

圖2 鞘流式流動閥接口結構示意圖

2 結果與討論

2.1 接口操作條件的優化

對于接口的操作來說, 影響其性能的因素主要包括 SPE 與 CE 毛細管之間的間距、緩沖液的流速、積累與進樣時間、沖洗時間等。本實驗選擇5 mmol·L-1H酸為待測液, 其流速設定為3 μL·min-1; 10 mmol·L-1Na3PO4溶液為緩沖液, 對接口的操作條件進行了優化。

經過優化, SPE 與 CE 毛細管間的距離70～120 μm 為宜。若間距過大, 會造成進樣量重現性的降低, 而且所需的樣品積累時間也要相應的加長; 而間距過小, CE 毛細管入口端的殘余組分不易被及時地沖洗干凈。緩沖液的流速范圍為16～80μL·min-1, 若流速低于16μL·min-1, 緩沖液的沖洗力度不夠, 不能保證樣品溶液全部遠離 CE 毛細管入口端, 會造成連續進樣現象; 而流速大于80μL·min-1時, 易產生殘壓和層流現象, 譜圖上峰高降低且出峰時間縮短。此外, 適宜的時間程序: 積累與進樣時間為3 s, 沖洗時間為1s。

2.2 接口性能的評價

本研究在上述優化的操作條件下, 主要從進樣效率、重現性、柱效與對稱性三方面對接口的性能進行了評價。

2.2.1 接口的進樣效率

接口的進樣效率, 即樣品在接口的濃度利用率, 直接影響到系統對樣品的檢測濃度。以5 mmol·L-1的H酸為研究對象, 在相同的操作條件下, 分別采用直接電泳進樣、經接口進樣兩種方式進行CE分離比較, 選取所得譜圖的一部分進行排列, 結果如圖3所示。從峰高即濃度的比值中可推知樣品經接口切換后濃度為初始濃度的98 %, 這表明在積累與進樣的過程中, 樣品幾乎沒被稀釋。經計算比較得知, 兩個毛細管間距離為100 μm時的死體積為20 nL, 而積累與進樣時間為3 s時樣品的流出體積為150 nL, 是死體積的7.5倍。也就是說, 此時兩個毛細管間全部充滿著樣品, 因而進樣的濃度幾乎就是樣品的原始濃度。這進一步說明了該鞘流接口的死體積小, 稀釋效應小, 從而不會對萃取效率帶來影響。

圖3 直接電泳進樣與經接口進樣的比較

2.2.2 接口的重現性

為了評價接口的長期穩定性和重現性, 以5 mmol·L-1H酸為樣品, 在約 4 小時內進行了100次電泳連續進樣實驗, 峰高、峰面積、遷移時間的散點圖如圖4所示。經計算, 峰高、峰面積及遷移時間的相對標準偏差(RSD)平均值分別為2.4 %、5.4 %、3.1 %, 均在誤差允許范圍內。從圖中可以看出, 峰高、峰面積并沒有明顯的漂移, 但遷移時間卻從1.52 min漂移到了1.65 min, 造成這一現象的原因可能是由于在長時間內緩沖溶液 pH 和室溫發生了變化。研究發現, 在這一時間段內, 由于緩沖溶液吸收了空氣中的二氧化碳使得其 pH 從 11.5 降至 11.2, 室溫從29 ℃降至25 ℃, 溫度的下降會導致緩沖液粘度的增加。pH 的降低和粘度的增加均會使電滲流有所下降, 遷移時間漂移。即便這樣, 所得的結果也表明該套系統足以實現SPE 與 CE 的高效在線聯用。

圖4 100次連續CE分離的峰高、峰面積及遷移時間

2.2.3 柱效與對稱性

在檢測波長 250 nm 的情況下, 通過分離 H 酸和 8-羥基喹啉-5-磺酸的混合溶液考察了接口對CE分離的影響。表1對比了直接電泳進樣和經接口進樣時兩種組分的柱效和峰的對稱性。因UV檢測的濃度靈敏度較低, 增大樣品濃度, 增加進樣體積或增加檢測窗口長度都會導致嚴重的峰展寬。此外, 與壓力進樣相比, 電動進樣中存在電荷歧視效應, 更容易造成峰展寬現象, 使得柱效損失。從峰的頂點向半峰寬所在線段作垂線, 相交后的形成的兩條線段分別為 a 和 b, b 與 a 的比值即為峰的對稱性。實驗發現峰形拖尾, 造成這一現象的原因一方面是由于在分離過程中樣品栓在電泳毛細管中軸向擴散, 另一方面是由于電荷歧視效應的存在使得分析物的自身泳動方向與電滲流方向相反。但在適當的操作條件下, 經接口進樣與直接電泳進樣相比, 柱效和對稱性變化不大, 說明接口并沒有對CE的分離帶來影響。

3 結論

本實驗選取性能良好且成本低廉的材料，設計并制作了一種新型鞘流式流動閥接口裝置，通過對電泳進樣重現性和稀釋效應的考察證實，本接口在吸納現有幾種接口裝置的優點的同時，有效克服了缺陷，具有制作方法簡單、制作成本低廉、柱外擴散和稀釋效應極小等顯著優點。可以很好地實現固相萃取與毛細管電泳的在線聯接。

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Design and Evaluation of a New Interface for the On-line Coupling of Solid-phase Extraction with Capillary Electrophoresis

LI Jin-xiang, SUN Yan, WANG Ya-lin

(School of Chemistry and Chemical Engineering, Liaoning Normal University, Dalian Liaoning 116029, China)

A new interface was presented for the on-line coupling of solid-phase extraction (SPE) with capillary electrophoresis (CE). The interface adopted a sheath flow design based on the flow gating principle. After optimizing the operation conditions, the performance of the interface was evaluated. By this interface, injection efficiency of concentration of effluent form SPE capillary into the CE system was up to 98%, indicating that almost no dilution effect occurred during injections in the interface. The relative standard deviations (RSD%) obtained through 100 consecutive runs over a 4.0 h period were 2.4%, 5.4% and 3.1%, respectively. These RSD values shown that the interface has a good stability and reproducibility.

solid-phase extraction; capillary electrophoresis; interface

2013-10-16

李金祥(1964- )，男，黑龍江綏化人，遼寧師范大學化學化工學院教授，博士，從事高效分離與靈敏檢測技術研究。

O657.7

A

1008-178X(2014)01-0069-04